反義Cx43對(duì)不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊的抑制作用研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌不穩(wěn)定(DI)是指儲(chǔ)尿期逼尿肌出現(xiàn)無(wú)抑制收縮，常繼發(fā)于膀胱出口梗阻(BOO)，是多種病變(如神經(jīng)疾病、膀胱出口梗阻等)的一個(gè)共同的病理生理環(huán)節(jié)，是最常見(jiàn)的一種膀胱功能障礙，是引起尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等臨床癥狀的直接原因，嚴(yán)重者還將引起腎、輸尿管積水和腎功能損害，嚴(yán)重影響了患者的健康狀況及生活質(zhì)量。有關(guān)DI的發(fā)生機(jī)理目前還不清楚。DI的臨床治療雖有多種方法，但療效不佳，亟待解決。 正常情況下逼尿肌的協(xié)調(diào)收縮主

2、要是由神經(jīng)參與支配的，逼尿肌細(xì)胞間的興奮傳遞作用并不起主導(dǎo)作用。DI情況下，逼尿肌的收縮是不受意志控制、自發(fā)的，其本身具有一定的自發(fā)興奮性。但是單個(gè)細(xì)胞的興奮是無(wú)法引起全膀胱的協(xié)調(diào)收縮的，單細(xì)胞興奮必須經(jīng)過(guò)特殊的細(xì)胞間興奮傳遞機(jī)制才能引起整個(gè)膀胱組織協(xié)調(diào)一致的收縮。因此，細(xì)胞間的興奮傳遞可能在DI發(fā)生中有極其重要的作用。 細(xì)胞間通訊對(duì)于多細(xì)胞生物體具有重要意義，其所介導(dǎo)的新陳代謝偶聯(lián)和電化學(xué)偶聯(lián)對(duì)于多細(xì)胞行為的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是不可或缺

3、的?？p隙連接是位于兩個(gè)相鄰細(xì)胞間的通道結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞間通訊的一條重要途徑。它允許分子量小于1000道爾頓的小分子物質(zhì)(如離子、第二信使、Ca2+、cAMP、cGMP等)在相鄰細(xì)胞間快速傳遞。除了紅細(xì)胞和成人骨骼肌細(xì)胞外，縫隙連接存在于哺乳動(dòng)物所有的組織中。 縫隙連接通道的直徑約30埃米，包括由相鄰細(xì)胞提供的兩個(gè)半通道，每個(gè)半通道(連接子)由屬于連接蛋白基因家族的六個(gè)蛋白亞基組成。到目前為止，在哺乳動(dòng)物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的連接蛋白已達(dá)20余種

4、，它們擁有相同的結(jié)構(gòu)：四個(gè)跨膜區(qū)，胞內(nèi)N末端、C末端以及兩個(gè)胞外連接袢。 縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊稱(chēng)為縫隙連接細(xì)胞間通訊，它參與了生物體內(nèi)的許多生物學(xué)過(guò)程，如子宮平滑肌細(xì)胞的協(xié)調(diào)收縮、相鄰細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和離子的交換、控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等等。在眾多的組織器官中，心肌組織中的縫隙連接通訊研究得最為充分，縫隙連接通訊可以介導(dǎo)對(duì)于心肌組織協(xié)調(diào)收縮具有重要意義的快速、有序的動(dòng)作電位傳播。 和心肌組織類(lèi)似，膀胱逼尿肌也具有自發(fā)性收縮

5、，逼尿肌不穩(wěn)定的典型特征就是逼尿肌不受意志控制的、自發(fā)的收縮活動(dòng)。因此，DI的產(chǎn)生可能與縫隙連接通訊有著密切的關(guān)系。但是目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于膀胱逼尿肌興奮傳遞的研究還鮮有報(bào)道。我們的前期研究已經(jīng)在組織水平證明DI情況下逼尿肌組織縫隙連接大量增加，相應(yīng)的細(xì)胞水平功能研究亦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間通訊功能加強(qiáng)。但是各種具體連接蛋白在逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊中所起的作用目前還不清楚，作為DI情況下增加較為顯著的連接蛋白，Cx43可能在此過(guò)程中起著重要作用，有必要

6、對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。同時(shí)，對(duì)這一問(wèn)題的研究有助于我們更深入地了解DI發(fā)生的機(jī)理，為探求以阻斷逼尿肌細(xì)胞間興奮傳遞為手段、探索新型有效的DI治療方法提供理論基礎(chǔ)。 本課題主要從以下幾個(gè)方面對(duì)逼尿肌細(xì)胞進(jìn)行研究：第一，在前一階段組織水平觀(guān)察的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究細(xì)胞水平Cx43基因表達(dá)變化以及逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能的改變，初步揭示Cx43以及GJIC與逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)系。第二，構(gòu)建Cx43基因反義真核表達(dá)載體ASCx43/pC

7、I-neo。第三，將Cx43基因反義真核表達(dá)載體ASCx43/pCI-neo導(dǎo)入培養(yǎng)的不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞，觀(guān)察Cx43基因封閉對(duì)逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊的影響，揭示Cx43在不穩(wěn)定逼尿肌發(fā)生中的作用，為臨床上采用阻斷細(xì)胞間興奮傳遞來(lái)治療DI開(kāi)辟新的方法及提供理論依據(jù)。 方法：本研究通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切、連接、轉(zhuǎn)化、提取等方法構(gòu)建了Cx43全長(zhǎng)反義真核表達(dá)載體。通過(guò)尿道近端不全結(jié)扎法建立了穩(wěn)定、合理的大鼠BOO后引起DI的模型。根據(jù)

8、尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果采用隨機(jī)法將動(dòng)物分為：逼尿肌穩(wěn)定組即正常對(duì)照組(controlgroup)，逼尿肌不穩(wěn)定組(DetrusorInstabilityGroup)。采用膠原酶消化法常規(guī)分離培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞，應(yīng)用半定量RT-PCR及Westernblot等方法從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平檢測(cè)連接蛋白Cx43基因及其蛋白的表達(dá)變化，利用劃痕標(biāo)記熒光燃料失蹤技術(shù)觀(guān)察不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞間GJIC的功能變化，最后反義基因轉(zhuǎn)染封閉Cx43基因的表達(dá)，觀(guān)察Cx43基因封

9、閉對(duì)不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊的抑制作用，揭示Cx43以及GJIC的功能變化與逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)系。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下： 1.Cx43mRNA在DI組及正常對(duì)照組膀胱逼尿肌細(xì)胞中均有表達(dá)，DI組表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，約為對(duì)照組的2.97倍，兩者相比較具有非常顯著性差異； 2.Cx43蛋白在DI組及正常對(duì)照組膀胱逼尿肌細(xì)胞中均有表達(dá)，DI組表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，約為對(duì)照組的3.15倍，兩者相比較具有

10、非常顯著性差異，與Cx43mRNA表達(dá)程度相近似。 3.DI組及正常對(duì)照組膀胱逼尿肌細(xì)胞間均存在縫隙連接通訊，DI組逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，約為對(duì)照組的5.61倍，兩者相比較具有非常顯著性差異； 4.成功構(gòu)建了Cx43基因反義真核表達(dá)載體； 5.反義轉(zhuǎn)染組Cx43mRNA的表達(dá)明顯降低，約為空載轉(zhuǎn)染組的61％，兩者相比較有非常顯著性差異； 6.反義轉(zhuǎn)染組Cx43蛋白的表達(dá)明顯降低

11、，約為空載對(duì)照組的56％，兩者相比較有非常顯著性差異； 7.反義轉(zhuǎn)染組逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能明顯降低，約為空載對(duì)照組的82％，兩者相比較具有顯著性差異。 結(jié)論：主要結(jié)論如下： 1.體外培養(yǎng)不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞中Cx43基因表達(dá)較正常對(duì)照組增加； 2.體外培養(yǎng)不穩(wěn)定逼尿肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能較正常對(duì)照組增強(qiáng)； 3.縫隙連接通訊功能的增強(qiáng)可能在DI的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用； 4.反義Cx4