PPARα介導(dǎo)的AMPK激活對心肌肥厚及能量代謝的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭、心律失常和猝死主要原因之一。本課題針對心肌肥厚的產(chǎn)生機制：AMPK/PPARα/能量代謝這一通路對心肌肥厚的影響提出。本課題對尋找新的治療心肌肥厚及心衰的靶點有重要意義。實驗分體內(nèi)、體外實驗和AMPK調(diào)控PPARα機制三大部分，是以原有研究激活單磷酸腺昔激活的蛋白激酶(AMPK)可抑制心肌肥厚為研究基礎(chǔ)，通過主動脈縮窄誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚及苯腎上腺素(PE)誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的心肌細胞肥大，觀察5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核

2、苷(AICAR)激活A(yù)MPK后心肌細胞過氧化物增殖物受體α(PPARα)表達、心肌能量代謝和肥大的變化以及siRNA技術(shù)阻斷PPARα通路后，心肌能量代謝和肥大變化，以其闡明PPARα/能量代謝在AMPK激活抑制心肌肥厚中的作用。
　　 第一節(jié)AMPK激活對心肌肥厚的抑制作用
　　 為了探討AMPK對壓力負荷誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚影響，我們分別利用AMPK激活劑AICAR(0.5 mgAICAR/g body wt/d)干預(yù)

3、主動脈縮窄(TAC)模型大鼠8周及PE誘導(dǎo)的培養(yǎng)肥大心肌細胞48小時。RT-PCR及[3H]亮氨酸摻入結(jié)果顯示AICAR有抑制肥大相關(guān)基因ANP和β-MHC mRNA表達作用及[3H]亮氨酸摻入作用(p＜0.05或0.01)。而AMPK抑制劑Compound C則促進培養(yǎng)心肌細胞肥大相關(guān)基因ANP和β-MHC mRNA表達及[3H]亮氨酸摻入。心臟超聲顯示AICAR有改善壓力負荷誘導(dǎo)的大鼠肥厚心臟心功能作用。小結(jié)：AMPK激活可抑制心肌

4、肥厚，改善心功能。
　　 第二節(jié)PPARα在AMPK激活抑制心肌肥厚中的作用
　　 為了探討PPARα是否參與AMPK調(diào)節(jié)心肌肥厚作用，我們通過RT-PCR和Western blot探討AICAR對壓力負荷誘導(dǎo)大鼠肥厚心肌PPARα mRNA和蛋白表達影響。結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較TAC組PPARα蛋白和mRNA表達明顯下調(diào)(p＜0.01)。AICAR可以逆轉(zhuǎn)TAC對PPARα的下調(diào)作用。體外研究也表明AICAR有抑制PE

5、誘導(dǎo)的肥大心肌細胞PPARα下調(diào)作用，而AMPK抑制劑Compound C則促進PPARα下調(diào)。熒光酶分析也顯示AICAR有增加PPARα轉(zhuǎn)錄活性作用，而Compound C則抑制PPARα轉(zhuǎn)錄活性。小結(jié)：AMPK激活通過激活PPARα信號抑制心肌肥厚。
　　 第三節(jié)PPARα-siRNA對AMPK抑制心肌細胞肥大的影響
　　 為進一步證實PPARα參與AMPK抑制心肌細胞肥大作用。我們檢測siRNA沉默PPARα后，A

6、ICAR對[3H]-亮氨酸摻入的影響。PPARα-siRNA抑制效率大約70％，PPARα被抑制后AICAR抑制PE誘導(dǎo)的[3H]-亮氨酸摻入受阻。該結(jié)果進一步支持AMPK激活抑制心肌肥厚通過PPARα信號通路。
　　 第四節(jié)AMPK對肥厚心肌脂肪酸代謝的作用
　　 為了解AMPK對肥厚心肌脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)作用，我們對大鼠離體心臟進行[14C]-棕櫚酸灌注探討肥大心臟對脂肪酸氧化影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAC組與假手術(shù)組比較脂肪酸

7、氧化能力下降，AICAR+TAC組脂肪酸氧化增加，高于TAC組。我們的體外研究結(jié)果也顯示PE誘導(dǎo)的肥大心肌細胞脂肪酸氧化下降，細胞內(nèi)脂肪酸沉積增加，AICAR促進脂肪酸氧化并減少細胞內(nèi)脂肪酸沉積。AICAR的這些作用在PPARα被小干擾抑制后受阻。結(jié)果表明激活A(yù)MPK可通過PPARα激活促進心肌細胞利用脂肪酸，減少脂肪酸在細胞內(nèi)沉積。小結(jié)：肥厚心肌脂肪酸氧化能力下降，AICAR抑制心肌肥厚同時改善脂肪酸代謝。
　　 第五節(jié)AMP

8、K對肥厚心肌葡萄糖代謝的作用
　　 為了解AMPK對肥大心肌葡萄糖酸代謝的調(diào)節(jié)作用，我們對大鼠離體心臟進行[14C]-葡萄糖灌注探討肥大心臟對葡萄糖代謝影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAC組與對照組比較葡萄糖攝取及氧化明顯增多(p＜0.01)，AICAR促進葡萄糖攝取但抑制葡萄糖氧化(p＜0.05)。我們的體外研究結(jié)果顯示PE誘導(dǎo)的肥大細胞葡萄糖利用增加，AICAR促進葡萄糖攝取，但不影響肥大心肌細胞對葡萄糖的氧化利用。轉(zhuǎn)染PPARα-siRN

9、A抑制PPARα表達后，不影響AMPK對心肌細胞葡萄糖利用。結(jié)果表明激活A(yù)MPK可促進葡萄糖利用，但激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)心肌葡萄糖代謝與PPARα無關(guān)。小結(jié)：激活A(yù)MPK抑制心肌肥厚可能與其逆轉(zhuǎn)能量代謝轉(zhuǎn)換有關(guān)，AMPK逆轉(zhuǎn)肥大心肌細胞能量代謝轉(zhuǎn)換主要通過調(diào)節(jié)脂肪酸實現(xiàn)。
　　 第六節(jié)AMPK調(diào)控PPARα機制
　　 AMPK激活抑制心肌肥厚通過再激活PPARα機制，但是AMPK調(diào)節(jié)PPARα的機制不清楚。通過對壓力負荷誘導(dǎo)

10、心肌肥厚分析我們發(fā)現(xiàn)，AICAR抑制心肌肥厚同時伴有磷酸化的P38表達增高，磷酸化ERK1/2表達下降。由此推測AMPK激活可能與磷酸化的P38和磷酸化ERK1/2信號有關(guān)。通過體外細胞培養(yǎng)研究，Western blot結(jié)果顯示磷酸化的P38在PE干預(yù)組與AICAR干預(yù)組比較沒有明顯差別(p＞0.05)，而AICAR干預(yù)明顯抑制磷酸化ERK1/2表達，AMPK抑制劑Compound C干預(yù)增加磷酸化ERK1/2表達。磷酸化ERK1/2表