山楂酸對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用以及基于MicroRNA調(diào)控的分子機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位。目前針對(duì)肺癌的治療主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等方法，多數(shù)肺癌患者在其病程的不同時(shí)期均需要接受化療治療。臨床常用的化療藥物雖然抗腫瘤作用確切、療效顯著，但有骨髓抑制、消化道反應(yīng)等毒副作用及腫瘤耐藥等問(wèn)題，嚴(yán)重影響患者對(duì)藥物的耐受性和治療效果，所以迄今為止臨床化療的效果仍不能令人滿意，為肺癌治療上的難點(diǎn)。
　　近年來(lái)從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分如:三尖杉?jí)A

2、、紫杉醇等抗腫瘤藥物，已經(jīng)成為臨床上腫瘤治療的常用藥物。從植物中提取的天然化合物因其廣泛的生物活性、低毒性和較少的副作用而備受關(guān)注。山楂酸(Maslinic acid)是從油橄欖、紅棗、枇杷葉、山楂等植物中分離得到的一個(gè)三萜類天然有機(jī)化合物，分子式C30H48O4，分子量為472.70。油橄欖中富含山楂酸，橄欖油是地中海沿岸各國(guó)人民傳統(tǒng)食用油，具有非常好的營(yíng)養(yǎng)保健作用，此外還被廣泛應(yīng)用于美容保健。地中海沿岸居民的體質(zhì)強(qiáng)壯、壽命長(zhǎng)，那里的

3、心血管病、癌癥、老年癡呆癥，三大疾病的發(fā)病率非常低。在我國(guó)，山楂酸多從枇杷葉中提取，枇杷廣泛分布于中南及陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南等地，全年皆可采收。山楂酸對(duì)人體的高安全性及多種生物活性，引起了人們極大的研究興趣。近年來(lái)的研究表明，山楂酸具有諸多藥理活性，如抗癌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗菌、抗糖尿病以及血管舒張、降膽固醇等作用。國(guó)內(nèi)對(duì)山楂酸抗腫瘤相關(guān)研究較少，近年國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，山楂酸對(duì)人結(jié)腸癌HT2

4、9細(xì)胞、人前列腺癌DU145細(xì)胞、小鼠黑色素瘤細(xì)胞等有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其中部分作用機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。目前為止，山楂酸對(duì)肺癌的影響國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。顯然山楂酸是一個(gè)非常有研究?jī)r(jià)值的天然產(chǎn)物，它可以作為抗腫瘤藥物深入研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　MicroRNA(miRNA)是19～24nt的非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控

5、作用。近年來(lái)的研究證明miRNA的改變?cè)谌祟惸[瘤中廣泛存在，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。miRNA直接或間接調(diào)控癌基因或抑癌基因表達(dá)，是近年來(lái)腫瘤研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)的miRNA有Let-7、miR-17-92、miR-21、miR-155、miR-200c、miR-126、miR-34、miR-31等幾十種。它們?cè)诜伟┲斜磉_(dá)升高或降低，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯，促進(jìn)或抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)分子生物學(xué)方法將肺癌中某些

6、特定miRNA的表達(dá)增強(qiáng)或抑制后，可以抑制肺癌的增殖，起到治療肺癌的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物也可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)升高或降低，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯發(fā)揮其抗腫瘤作用。miRNA可以作為藥物治療腫瘤的新靶點(diǎn)，在腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)、藥物抗腫瘤機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)研究山楂酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用以及基于microRNA調(diào)控的分子機(jī)制，為深入研究山楂酸抗腫瘤機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為應(yīng)用于臨床治療肺癌提供理論

7、依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法:
　　一、山楂酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響的研究采用四甲基偶氮噻藍(lán)(MTT)法檢測(cè)山楂酸對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化;采用Western blotting方法檢測(cè)山楂酸對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，9的表達(dá)的影響。
　　二、山楂酸與順鉑合用對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響的研究
　　采用四

8、甲基偶氮噻藍(lán)(MTT)法檢測(cè)山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用以及合用對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)2用以及合用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;熒光顯微鏡觀察山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用以及合用對(duì)細(xì)胞核的形態(tài)變化的影響;采用Western blotting方法檢測(cè)山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用以及合用對(duì)凋亡相關(guān)蛋白XIAP、Survivin的表達(dá)的影響。
　　三、MicroRNA在山楂酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞抑制作用中的

9、研究
　　利用AFFX miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)山楂酸作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異，篩選出山楂酸抑制A549細(xì)胞作用的靶miRNA，預(yù)測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因及細(xì)胞凋亡相關(guān)靶基因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、山楂酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示隨著濃度的加大，山楂酸對(duì)A549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比差異具有顯著性。流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率表

10、明隨著山楂酸濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，與對(duì)照組相比差異具有顯著性。熒光電子顯微鏡觀察山楂酸作用后的細(xì)胞中可見(jiàn)染色體邊集、核碎裂等典型的凋亡改變，而對(duì)照組沒(méi)有相應(yīng)的變化。經(jīng)過(guò)不同濃度山楂酸處理A549細(xì)胞24小時(shí)后，Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著山楂酸濃度的不斷增加，Caspase-3，9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，CleavedCaspase-3，9蛋白表達(dá)水平逐漸增加。
　　二、山楂酸

11、與順鉑合用對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響的研究
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果，山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用均可抑制A549細(xì)胞的增殖，二者合用明顯增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，與對(duì)照組相比差異具有顯著性。流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率表明山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用均可引起A549細(xì)胞凋亡，二者合用明顯增加A549細(xì)胞凋亡率，與對(duì)照組相比差異具有顯著性。熒光電子顯微鏡觀察山楂酸、順鉑單獨(dú)作用A549細(xì)胞后細(xì)胞核形態(tài)均發(fā)生顯著性改變，呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核固縮

12、、核片斷化，二者合用時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增多，核碎裂明顯，細(xì)胞大片脫落形成細(xì)胞脫失區(qū)。Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示，山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用均可降低XIAP、Survivin蛋白的表達(dá)，二者合用可使XIAP、Survivin蛋白的表達(dá)明顯降低。
　　三、MicroRNA在山楂酸抑制A549細(xì)胞中的作用
　　AFFX miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)山楂酸作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異，篩選出山楂酸抑制A549細(xì)胞

13、的靶miRNA，其中59個(gè)miRNA表達(dá)顯著差異（大于10倍以上改變），23個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，36個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，由上述miRNA調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白400余個(gè)，細(xì)胞凋亡相關(guān)靶蛋白300余個(gè)，其中XIAP是miR-630下游調(diào)控的靶蛋白。
　　結(jié)論:
　　1、山楂酸可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，這種抑制作用具有濃度依賴性;山楂酸抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，凋亡通路之

14、一可能是線粒體凋亡通路。
　　2、山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用均對(duì)肺癌A549細(xì)胞有增殖抑制效應(yīng)及誘導(dǎo)凋亡作用，二者合用有協(xié)同作用;山楂酸、順鉑單獨(dú)應(yīng)用均可下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin，二者合用可增強(qiáng)對(duì)凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin的下調(diào)作用。
　　3、59個(gè)miRNA參與了山楂酸對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用，其中23個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，36個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，由上述miRNA調(diào)控的細(xì)胞增殖