HIV-1感染疾病長期不進展者CD8+T淋巴細胞非細胞毒性免疫應答作用的研究.pdf

1、目的：CD8+T淋巴細胞在機體抗HIV-1感染的免疫反應中具有細胞毒性和非細胞毒性的免疫應答(CNAR)。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是細胞免疫反應中殺滅HIV的主要效應細胞，但是單純靠CTL介導的細胞免疫作用不足以保護機體免受HIV感染。CNAR功能通過分泌抗病毒因子抑制HIV感染細胞及HIV復制，在抗HIV感染中具有重要作用。近年來，國外關(guān)于CNAR功能的研究主要以無癥狀感染者為研究對象，對疾病長期不進展者(LTNP)和艾滋病期的患

2、者研究較少。LTNP是HIV-1感染超過10年，未經(jīng)任何抗病毒治療，CD4+T淋巴細胞數(shù)大于或等于500×10<'6>個/1，未出現(xiàn)艾滋病指征性癥狀的患者，疾病呈現(xiàn)長期不進展狀態(tài)。CNAR功能可能在維持LTNP較好的免疫功能中發(fā)揮了重要作用，但其機制尚未明確。IL-15是一種多功能的細胞因子，能夠促進體內(nèi)NK細胞和記憶性T淋巴細胞分化和增殖，在機體抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。國外研究顯示IL-15能夠增強無癥狀感染者CNAR功能，但CNA

3、R功能在LTNP中的變化以及是否與IL-15相關(guān)國內(nèi)外均未見報道。本研究以中國HIV感染LTNP為對象，研究其外周血中CD8+T淋巴細胞CNAR功能的變化及IL-15對CNAR功能的影響，并與HIV組、AIDS組及健康對照組進行比較，探討其與疾病進展的關(guān)系。 方法: 1、研究對象 由中國醫(yī)科大學艾滋病研究所、遼寧省疾病預防與控制中心以及吉林省疾病預防與控制中心、河南省疾病預防與控制中心艾滋病確認實驗室經(jīng)Weste

4、rn blot試驗確認為HIV陽性標本52例，所有標本均在未接受抗病毒治療前采集。根據(jù)HIV感染者CD4+T細胞數(shù)量和感染時間進行分組。LTNP組：CD4+T淋巴細胞≥500個/μl，HIV感染10年以上，未經(jīng)抗病毒治療，無艾滋病指征性癥狀；HIV組：CD4+T淋巴細胞介于200-500個/μl之間，無艾滋病指征性癥狀；AIDS組：CD4+T淋巴細胞<200個/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性癥狀。其中LTNP組17例，HIV組28例，AIDS組

5、7例，健康對照組8例。每例采集EDTA抗凝全血9ml。 2、T淋巴細胞絕對計數(shù) 將20μlCD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μlEDTA抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血450μl，室溫避光15min，用FACS MULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞絕對值及相應比值等。 3、病毒株TCID<,50>檢測 HIV病

6、毒株為中國CDC參比實驗室惠贈的實驗室毒株SF33。提取健康人外周血單個核細胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)，PHA刺激3天，用RPMI-1640(含100U/ml IL-2)重懸，調(diào)整濃度為4×10<'6>個/ml，放入37℃、5％CO<,2>，孵箱中待用。在96孔板中部選12孔，每孔加入180μl RPMI-1640，PBMC 50μl。每孔加入200μl病毒，在板上做4倍系列稀釋。

7、3天后換液，第7天測p24，計算TCID<,50>。 4、CD4+T/CD8+T淋巴細胞的分選 用密度梯度離心法提取8例健康對照和52例HIV感染者的PBMC。采用德國Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分選裝置，嚴格按照說明書進行操作。每1×10<'7>個細胞加20μl抗CD4或抗CD8免疫磁珠，10℃結(jié)合25min。300g離心10min，500μl緩沖液重懸細胞，經(jīng)LS柱子進行陽性分選。取少量分選后細胞加入6μl

8、CD4-FITC、6μl CD8-PE及61μl CD3-PerCP，用流式細胞儀Cellquest軟件檢測分選細胞純度。 5、T淋巴細胞的體外培養(yǎng) 用37℃水浴復蘇病毒。準備15ml離心管，每管加入5×10<'5>個CD4+T細胞和600TCID<,50>的病毒，并用1ml吸管輕輕吹打20次，混勻后37℃、5％CO<,2>孵箱共培養(yǎng)3h。300g10min離心兩次，洗去游離的病毒，向每管加入0.5ml RPMI-164

9、0 (IL-2100U/ml)，重懸使細胞濃度為1×10<'6>個/ml。將預刺激72h的CD8+T細胞重懸，調(diào)整濃度到1×10<'6>個/ml。將CD8+T細胞和CD4+T細胞以2∶1、1∶1、0.5∶1的比例加入到48孔板中，固定CD4+T細胞的數(shù)量為0.4×10<'6>個/孔，每個濃度設(shè)2個復孔，同時設(shè)定2個陰性對照。調(diào)整每孔的液體總量為1.2ml。37℃、5％CO<,2>孵育，每3天換液收集上清600μl，同時補充600μl R

10、PMI-1640，培養(yǎng)至15天。在實驗孔中加入IL-15，濃度為300ng/ml，對照孔中只加入細胞，培養(yǎng)15天。 6、p24檢測 采用Biomerieux公司的p24檢測試劑盒，嚴格按照操作說明書進行。結(jié)果用pg/ml表示，最低檢測范圍是5pg/ml。 7、CNAR功能分析 將收集5次的上清p24值用Excel繪制折線圖，應用Origin7.0軟件計算曲線下面積，根據(jù)下列公式計算出CNAR功能。CNAR

11、功能％=對照組面積-實驗組面積/對照組面積×100％對照組面積. 8、統(tǒng)計學分析： 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后為正態(tài)分布。用方差分析(ANOVA)進行不同組間的均值比較。用直線相關(guān)來比較CNAR功能與CD4+T淋巴細胞絕對值及HIV-1 RNA病毒載量的相關(guān)性。 結(jié)論: 1.我國LTNP的CNAR功能高于HIV組、健康對照組和AIDS組。提示CNAR功能可能是我國HIV感染疾