MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒基因復制的分子機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可引起慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌嚴重危害人類健康，是醫(yī)學界多年來致力攻關(guān)的一個難題。α-干擾素(Interferon alpha，IFN-α)是目前少數(shù)臨床治療乙型肝炎有效的藥物之一，但對其抗病毒機制尚未完全明了。本室前期研究結(jié)果表明，IFN-α誘生的髓樣細胞分化蛋白(MyD88)可發(fā)揮抗HBV復制的作用，可導致細胞總成分和胞漿中的HBVRNA水平顯著下調(diào)，提示在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)

2、控HBV的復制。 目前已知，MyD88蛋白是Toll樣受體、白介素-1受體、白介素-18受體介導的信號通路中的關(guān)鍵分子，可通過信號級聯(lián)最終引起核因子kappa B(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)依賴性信號通路的活化。 已有研究表明，部分細胞因子以及干擾素誘生的抗病毒蛋白可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HBV的基因復制和表達，機理涉及對HBV RNA核外運輸以及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，但尚不清楚IFN-α誘生的My

3、D88蛋白是否以同類機制在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HBV的基因復制。本課題擬從細胞信號轉(zhuǎn)導以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控兩方面探討MyD88蛋白抑制HBV復制的分子機制。 為探討MyD88蛋白介導的NF-κB信號系統(tǒng)活化在抗HBV效應(yīng)中的作用，首先構(gòu)建了MyD88的截短突變體，然后與HBV復制型質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細胞，研究它們對HBV復制的影響。 結(jié)果證實，MyD88全長蛋白、及其兩個截短突變體M(1-151)、M(151-296)活化NF

4、-κB的程度不同，并與抑制HBV蛋白以及復制中間體DNA合成的水平相一致，提示MyD88蛋白抑制HBV復制的效應(yīng)與MyD88激活NF-κB信號通路相關(guān)。進一步以NF-κB的超抑制劑(super-repressor)IkBa-SR抑制NF-κB信號通路，研究NF-κB信號通路在MyD88拮抗HBV效應(yīng)中的作用。 結(jié)果顯示，與空載相比，單獨轉(zhuǎn)染MyD88和HBV的細胞中HBV core蛋白的合成顯著降低；而當加入IκBα-SR共同瞬

5、轉(zhuǎn)后細胞中core蛋白的表達量顯著增加。檢測HBeAg和HBsAg以及HBV復制中間體DNA，得到相似結(jié)果，上述結(jié)果提示MyD88蛋白抑制HBV復制的效應(yīng)依賴于NF-κB信號通路的活化。 進一步將HBV的復制型質(zhì)粒與NF-κB信號通路激活劑-IKKα/IKKβ表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IKKα/IKKβ在細胞內(nèi)過表達后可顯著降低細胞培養(yǎng)上清中HBeAg和HBsAg和復制中間體DNA的合成，并呈劑量依賴關(guān)系。

6、同時將HBV復制型質(zhì)粒和IKKα/IKKβ、MyD88、IκBα-SR 分別或共同轉(zhuǎn)染后檢測HBV RNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染IKKα/IKKβ或MyD88均可抑制HBV在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄；而IκBα-SR轉(zhuǎn)染細胞中HBV RNA轉(zhuǎn)錄體水平則上調(diào)。以上結(jié)果提示，NF-κB信號通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV復制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，為排除p38 MAPK或ERK1/2活化在MyD88蛋白抑制HBV復制中的作用，在MyD88與HBV復

7、制型質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細胞時加入SB20538或PD98059以抑制p38 MAPK或ERK1/2的活化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白抑制HBV的效應(yīng)在抑制劑處理組與非處理組間無顯著差異，提示MyD88蛋白調(diào)控HBV復制不依賴p38和ERK1/2信號通路的活化。為進一步探討MyD88蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HBV復制的機理。首先采用HBV啟動子控制下的報告基因，檢測MyD88蛋白對HBV啟動子的活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyD88蛋白對H

8、BV啟動子活性無顯著影響，排除了MyD88蛋白通過調(diào)節(jié)乙肝病毒啟動子活性抑制HBV轉(zhuǎn)錄激活的可能性。進一步在Huh7細胞中瞬時轉(zhuǎn)染HBV復制型質(zhì)粒和MyD88表達質(zhì)粒，分離細胞核與細胞漿中的HBVRNA，用RNA slot和real-time PCR分析HBV RNA在兩者中的分布。 結(jié)果顯示，表達MyD88蛋白可同時下調(diào)細胞核與細胞漿中HBV mRNA的水平，但HBVRNA的核/漿比值增加了了2～3倍，提示MyD88蛋白有可能

9、通過改變HBV RNA的核、漿分布比例從而影響HBV的基因復制。進一步利用轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件PRE(posttranscriptional regulate element)調(diào)控下的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報道系統(tǒng)分析MyD88蛋白將HBV RNA滯留于細胞核內(nèi)的可能機理。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MyD88穩(wěn)定表達細胞株中報道基因CAT的表達水平顯著降低；在Huh7細胞中采用瞬時轉(zhuǎn)染的方式也證明MyD88蛋白可特異性地抑制報道基因的表達，提示

10、MyD88蛋白影響PRE序列介導的HBV mRNA的核外運輸過程。另外，進一步對細胞轉(zhuǎn)染MyD88后HBV RNA的半衰期檢測發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白可降低HBVRNA的穩(wěn)定性。 以上研究結(jié)果提示，MyD88蛋白可能通過影響PRE序列介導的HBV mRNA的核外運輸過程、降低HBV RNA的穩(wěn)定性來調(diào)控HBV的復制。 綜上所述，在本室前期研究發(fā)現(xiàn)IFN-α誘生的髓樣細胞分化蛋白(MyD88)可發(fā)揮抗HBV復制作用的基礎(chǔ)上，本

11、研究進一步證實NF-κB信號通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV復制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而MyD88蛋白可能通過影響PRE序列介導的HBV mRNA的核外運輸過程、降低HBV RNA的穩(wěn)定性來調(diào)控HBV的復制。以上發(fā)現(xiàn)豐富了對干擾素誘生的MyD88蛋白抑制HBV復制機理的認識。從多角度深入探討MyD88蛋白調(diào)控HBV復制的分子機制，可有利于加深對細胞信號轉(zhuǎn)導機制以及細胞基因功能等的認識，揭示病毒和宿主細胞相互作用的分子機理，并可為臨床治療