自噬在糖皮質激素調控成骨細胞功能中的作用和機制.pdf

1、目的：通過從細胞自噬角度探討糖皮質激素對成骨細胞的調控，即糖皮質激素是否引起成骨細胞自噬，自噬流的強弱是否與糖皮質激素劑量及作用時間有關，以及人為干預自噬是否對當皮質激素作用下的成骨細胞功能產生影響，進一步拓展了激素相關骨質疏松的病理機制，對闡明自噬是否參與了糖皮質激素誘導的骨質疏松(GIOP)，以及為發(fā)現抗骨質流失藥物新靶點提供了重要參考價值。
　　方法：首先將培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1等量接種于六孔板中，待培養(yǎng)一段

2、時間后，分別加入含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)基(10-8M，10-6M，10-4M)，分別在1d，2d，3d，4d時間點收集細胞。①通過Western blot技術檢測成骨細胞內源性自噬相關蛋白LC3及Beclin1的表達量，探討地塞米松是否誘導了細胞自噬以及自噬水平是否與激素劑量和作用時間有關。②使用能表達綠色熒光蛋白GFP的LC3B質粒轉染細胞，然后再與含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)液共同作用，通過熒光共聚焦顯微鏡檢測細胞質內是否有特征性

3、的GFP-LC3B聚集，即直視下觀察是否有自噬小體的形成以及自噬小體陽性細胞的數量。③應用流式細胞儀檢測地塞米松作用下成骨細胞的凋亡情況，以及人工干預自噬是否可以調控成骨細胞凋亡。④最后，應用熒光定量PCR技術檢測地塞米松作用下，功能基因的表達情況，以及加入自噬誘導劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA后，成骨細胞功能基因表達是否發(fā)生變化。
　　結果：1.蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測顯示地塞米松誘導下，MC3T3-E1

4、細胞中有LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表達;熒光共聚焦顯微鏡顯示細胞質內有GFP-LC3B斑點產生。
　　2.隨著培養(yǎng)液中地塞米松濃度的升高，Western blot檢測成骨細胞內源性自噬相關蛋白LC3B及Beclin1表達均呈上升趨勢。熒光共聚焦顯微鏡檢測eGFP-LC3B標記的自噬小體。培養(yǎng)液中藥物濃度上升時，eGFP-LC3B斑點數量上升、更加濃聚，eGFP-LC3B陽性細胞數量增多。
　　3.隨著Dex作用時間延長

5、，細胞中自噬相關蛋白LC3B及Beclin1的表達在48小時達到峰值，隨后下降。鏡下觀察eGFP-LC3B陽性細胞數量以及熒光斑點形成情況也與Western blot檢測蛋白表達情況相符。
　　4.隨著地塞米松濃度升高，MC3T3-E1細胞凋亡率增加;加入自噬抑制劑3-MA后，細胞凋亡率上升。
　　5.隨著地塞米松濃度升高，MC3T3-E1細胞Alp、Colla1、Ocn基因的表達量下降。加入自噬抑制劑3-MA后，基因表達量

6、進一步降低，加入自噬誘導劑雷帕霉素后，基因表達量下降不明顯。
　　結論:1.糖皮質激素GCs可以誘導小鼠成骨細胞系MC3T3-E1的自噬發(fā)生
　　2.細胞中自噬水平與地塞米松作用濃度呈正相關;自噬水平在地塞米松作用48h達到峰值，而后隨著時間延長而下降
　　3.地塞米松誘導小鼠成骨細胞的凋亡，且濃度增加凋亡率增高。抑制自噬可以促進細胞的凋亡。
　　4.地塞米松抑制小鼠成骨細胞基因的表達，抑制作用隨濃度增加而增加。