水稻種胚LOX3基因及啟動(dòng)子的功能分析.pdf

1、脂氧合酶是含有非血紅素鐵的雙加氧酶，專一催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸，通過(guò)加入分子氧將它們轉(zhuǎn)化成具有共軛雙鍵的氫過(guò)氧化物脂肪酸。脂氧合酶廣泛存在于植物體中，參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老及脅迫反應(yīng)的各個(gè)過(guò)程。水稻成熟種胚中存在3種脂氧合酶同工酶，分別命名為L(zhǎng)OX1，LOX2和LOX3，LOX3主要生成9-D-氫過(guò)氧基．10，12(E，Z)．十八碳二烯酸，在胚成熟過(guò)程中大量表達(dá)，占未萌發(fā)水稻種子LOX總活性的80～9

2、0％。本研究獲得了轉(zhuǎn)化LOX3cDNA和啟動(dòng)子的水稻轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和分析來(lái)了解LOX3基因和啟動(dòng)子的功能，主要結(jié)果如下： 1．構(gòu)建了水稻種胚LOX3 cDNA的正義和反義植物表達(dá)載體和從常規(guī)品種越光和LOX3缺失品種Daw Dam中克隆的2個(gè)LOX3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的植物表達(dá)載體。 2．獲得了轉(zhuǎn)化正義和反義LOX3 cDNA及轉(zhuǎn)化LOX3啟動(dòng)子的水稻轉(zhuǎn)基因植株。 3．PCR和Souther

3、n鑒定證實(shí)基因已經(jīng)導(dǎo)入水稻基因組中，種胚LOX3缺失鑒定和半定量RT-PCR分析說(shuō)明反義抑制了LOX3基因的表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)的變異性狀進(jìn)行了調(diào)查。 4．對(duì)LOX3啟動(dòng)子的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，從常規(guī)品種越光和LOX3缺失品種DawDam中克隆的啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，說(shuō)明LOX3的缺失非啟動(dòng)子突變?cè)斐?。啟?dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、花藥、種胚及種皮中均有表達(dá)，在萌發(fā)種子的胚和胚芽中表達(dá)，在胚乳中不表達(dá)

4、，其在水稻中的表達(dá)活性要顯著高于CaMV 35S啟動(dòng)子，說(shuō)明LOX3啟動(dòng)子是一個(gè)高效安全的啟動(dòng)子。 5．構(gòu)建了2個(gè)LOX3啟動(dòng)子的5’端缺失體，對(duì)2個(gè)啟動(dòng)子缺失體的水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS活性分析，2個(gè)缺失體的活性均高于啟動(dòng)子全長(zhǎng)，說(shuō)明缺失的區(qū)域中存在著未知的負(fù)調(diào)控元件，兩個(gè)缺失體的活性也存在差異，說(shuō)明缺失體之間也存在較重要的調(diào)控元件。 6．分析了轉(zhuǎn)基因T1代植株的誘導(dǎo)表達(dá)特性，GUS定量檢測(cè)結(jié)果表明，LOX3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)

5、的GUS活性可被誘導(dǎo)增強(qiáng)，其中ABA的效果最明顯，陳化和NaCI處理次之，證實(shí)了啟動(dòng)子中存在相應(yīng)的誘導(dǎo)元件存在功效，LOX3啟動(dòng)子是一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，受逆境脅迫信號(hào)誘導(dǎo)。 7．對(duì)反義LOX3的T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鹽、干旱脅迫處理以及稻瘟病、條紋葉枯病、白葉枯病的接種鑒定，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，反義LOX3轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽、干旱等非生物脅迫有一定的敏感性，在對(duì)生物脅迫的感受性中，稻瘟病接種鑒定效果最明顯，白葉枯病接種效果較明顯，