Caveolin-1在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確肝損因素所致的以肝細胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD患病率近年來逐年增高，我國已達到15％左右，西方發(fā)達國家更是高達20％-30％，成為最常見的慢性肝病之一，構(gòu)成日益嚴重的社會健康問題[2，3]。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變，從單

2、純性脂肪肝到脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[4]?？偟膩碚f，單純性NAFLD是一種良性疾病，而NASH卻可以逐漸向肝硬化、肝癌等終末期肝病進展[4、5]。
　　NAFLD發(fā)生發(fā)展機制目前尚未完全明確，其治療也缺乏特別有效方法?！岸未驌簟睂W說[6]認為，胰島素抵抗引起的外周脂肪分解增加和高胰島素血癥，是導致肝細胞脂肪變性的首要因素;國外針對這一機制設(shè)計的臨床試驗結(jié)

3、果提示改善胰島素抵抗并非對所有NAFLD患者均有效，其主要原因是“二次打擊”學說并不能完全解釋NAFLD的全部機制，提示還存在其他機制參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。NAFLD的發(fā)生是肝細胞不斷貯積脂質(zhì)的過程，從肝細胞脂質(zhì)貯積的分子機制切入或許可為認識NAFLD發(fā)生發(fā)展機制提供新的線索。微囊蛋白1（Caveolin-1）是分子量為21-24kD的多功能信號蛋白，為小凹家族中最重要的成員，富集于細胞膜特異結(jié)構(gòu)小凹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等，并可在胞漿

4、和胞膜之間穿梭。Caveolin-1的氨基酸序列中包括一段長達33個氨基酸(102-134氨基酸殘基)的疏水區(qū)域，該疏水區(qū)域兩端均帶有一個脯氨酸殘基，借助這兩個脯氨酸殘基形成一個N末端、 C末端均面向胞漿的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。其中N末端(82-101氨基酸殘基)是人類Caveolin-1蛋白序列中高度保守的骨架區(qū)域。已有研究顯示，Caveolin-1在保持質(zhì)膜微囊的完整性、小胞運輸、信號的傳導中均起重要作用[7]。
　　近年來，Caveol

5、in-1在脂質(zhì)代謝中的作用受到越來越多的關(guān)注。Frank等觀察到Caveolin-1表達缺失小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后不出現(xiàn)肥胖，提示Caveolin-1是高脂飲食誘發(fā)肥胖的關(guān)鍵基因之一[8]。后續(xù)動物實驗發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1表達缺失可預(yù)防動脈粥樣硬化、2型糖尿病等糖脂代謝紊亂疾病的發(fā)生，提示Caveolin-1在這些代謝性疾病中的重要作用[9，10]。
　　為此，本研究利用高脂飲食建立NAFLD小鼠模型、FFA誘導L02細胞脂肪變

6、性，應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法，檢測微囊蛋白-1 mRNA及蛋白表達水平，及其對脂質(zhì)合成相關(guān)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1）、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、環(huán)氧合酶2(COX-2)等的作用，探索Caveolin-1在NAFLD發(fā)病中的作用及可能機制。
　　目的:
　　本研究旨在通過觀察NAFLD小鼠肝組織Caveolin-1的mRNA和蛋白的表達情況及FFA誘導脂肪變性的L

7、02細胞中，通過抑制或高表達Caveolin-1觀察SREBP-1、FASN、ACC、COX-2的變化及TG濃度變化，探究其對脂質(zhì)合成的作用。
　　方法:
　　1在體小鼠模型建立:高脂飲食喂養(yǎng)C57小鼠建立NAFLD動物模型，具體方法為:雄性SPF級C57小鼠根據(jù)體重分層，隨機化分組，對照組喂養(yǎng)普通飼料，實驗組喂養(yǎng)高脂飼料（80.5％普通飼料、2％膽固醇、7％豬油、10％蛋黃粉和0.5％膽鹽）。造模第4周，第8周、12周末處

8、死小鼠。
　　2細胞模型建立:采用軟脂酸誘導正常人肝細胞株L02細胞建立NAFLD體外模型，具體方案為:正常人肝細胞株L02細胞用含胎牛血清、青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，直至細胞達到80-100％融合度。軟脂酸和油酸混合物終濃度1mM（軟脂酸∶油酸=1∶2），添加胎牛血清白蛋白1％加入DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后收獲。油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴形成情況，收集細胞凍溶液測定其中TG的含量，綜合評估建模情況。
　　3從小鼠肝

9、臟組織中、FFA誘導L02細胞中提取RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)合成的Caveolin-1引物進行實時熒光定量PCR(SYBR法)，對Caveolin-1的mRNA在兩組小鼠中及FFA誘導L02細胞中的變化進行相對定量分析。
　　4從小鼠肝臟組織、FFA誘導L02細胞中提取總蛋白，行Western Blot。觀察實驗組和對照組小鼠肝臟及FFA誘導L02細胞中Caveolin-1在蛋白水平的變化，進一步證實其變化是否與mRNA水平變

10、化相對應(yīng)。
　　5運用siRNA和重組腺病毒載體的方法，抑制或增強NAFLD細胞模型Caveolin-1的表達，檢測肝細胞的脂肪變性程度，并進一步運用實時熒光定量PCR和Western Blot等方法，檢測Caveolin-1表達抑制或增強后， NAFLD細胞模型中SREBP-1、FASN、ACC、COX-2指標的變化及可能機制。
　　結(jié)果:
　　1 NAFLD小鼠肝組織Caveolin-1 mRNA及蛋白表達比對照組

11、明顯下降。
　　2 FFA誘導L02細胞脂變過程中Caveolin-1 mRNA及蛋白表達比空白對照組明顯下降。
　　3抑制Caveolin-1后L02細胞脂變加劇，與脂質(zhì)合成相關(guān)的蛋白SREBP-1、FASN、ACC、COX-2蛋白水平升高，高表達Caveolin-1后L02細胞脂變改善，與脂質(zhì)合成相關(guān)的蛋白SREBP-1、FASN、ACC、COX-2蛋白水平降低
　　結(jié)論:
　　Caveolin-1可能在NA