補腎壯骨中藥對頜骨牽張成骨影響的機制探討.pdf

1、目的：
　　 牽張成骨(distraction of osteogenesis,DO)作為活體骨組織工程的一種重要形式,為矯治各種先天及后天獲得性畸形或缺損提供了重要手段。作為內(nèi)源性組織工程技術(shù),該方法與傳統(tǒng)外科技術(shù)相比,具有諸多優(yōu)點,如操作簡單、術(shù)時短、創(chuàng)傷小、避免植骨及供區(qū)并發(fā)癥、軟組織可同期得到擴張。但是,由于DO的療程相對較長,且有時會出現(xiàn)纖維性愈合、骨愈合不良、甚至骨不連等并發(fā)癥,這些問題使得牽張成骨術(shù)的臨床應用在一定

2、程度上受到了限制。目前,許多方法被嘗試用于促進牽張骨痂形成,縮短DO固定期,這些方法包括應用低頻超聲波、直流電或電磁場刺激、高壓氧治療、系統(tǒng)應用生長激素、以及局部應用生長因子、骨形成蛋白等。部分方法獲得了一定的效果,然而所有上述手段均未獲得廣泛的臨床應用。
　　 中醫(yī)中藥在醫(yī)學的某些領域已顯示出其獨特、不可替代的作用和地位。中醫(yī)中藥能加速骨折的愈合,早已被臨床證實。祖國醫(yī)學在促進新骨形成、骨折愈合方面積累了大量經(jīng)驗。隨著各種研究

3、方法的介入,其治療骨折的部分機制,目前已經(jīng)闡明。在促進牽張成骨方面,在我們以往的研究中,已觀察到補腎壯骨中藥可以促進下頜骨牽張成骨的作用,補腎壯骨中藥如何促進成骨,通過什么途徑促進牽張成骨,目前還是未知。一些研究表明,傳統(tǒng)中藥可促進成骨細胞分化和增殖,可通過調(diào)節(jié)成骨基因、細胞因子促進骨折的愈合。因此,借鑒在治療骨折等方面的成功經(jīng)驗,中醫(yī)中藥在縮短牽張成骨療程方面必能發(fā)揮巨大作用,使得牽張成骨更加完善,手術(shù)并發(fā)癥更少,患者更容易接受,因此

4、有著廣闊的應用前景。
　　 本研究首先應用補腎壯骨中藥含藥血清作用于體外培養(yǎng)的犬骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow stem cells,MSCs),觀察中藥對骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化增殖的影響,同時也檢測中藥對成骨細胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨保護素(osteocalcin,OPG)和細胞核因子κΒ受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor

5、κΒ ligand,RANKL)等成骨的作用,探討補腎壯骨中藥對牽張成骨骨改建的作用機理;本研究將補腎壯骨中藥應用于犬下頜骨牽張成骨,采用組織形態(tài)學、骨組織計量學及骨鈣素(osteocalcin,OCN)mRNA的表達,觀察下頜骨牽張成骨過程中補腎壯骨中藥對成骨質(zhì)量和骨鈣素的影響。本研究擬從細胞水平和分子水平初步探討補腎壯骨中藥促進骨再生和加速骨愈合的機制,為補腎壯骨中藥在DO中的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　

6、 1補腎壯骨中藥對犬骨髓干細胞成骨分化增殖的影響
　　 (1)MSCs原代培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)及成骨活性的鑒定
　　 2只Beagle犬由脛骨獲取骨髓,經(jīng)Ficoll分離液進行梯度離心,MSCs經(jīng)含胎牛血清的DMEM培養(yǎng),傳代后在培養(yǎng)液加入礦化誘導液(β-甘油磷酸鈉,維生素C和地塞米松)促使其向成骨細胞分化,I型膠原蛋白免疫組化鑒定成骨細胞,銀染色和茜素紅染色鑒定鈣結(jié)節(jié)。
　　 (2)實驗分組及含藥血清的制備
　

7、　 實驗分為含藥血清組(A組)、無藥血清組(B組)和胎牛血清組(C組)。含藥血清組的血清來自補腎壯骨中藥經(jīng)煎制后,按體表面積折算等效劑量,2只Beagle犬連續(xù)喂服7天后經(jīng)股動脈采血制備而成。無藥血清組的血清來自等劑量生理鹽水2只Beagle犬喂服7天后經(jīng)股動脈采血制備而成。胎牛血清組的血清直接購買。
　　 (3)含藥血清對MSCs分化生長的影響
　　 分別將第3代MSCs在含藥血清(A組)、無藥血清(B組)和胎牛血清

8、(C組)的誘導礦化液+DMEM中培養(yǎng)。通過四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法觀察MSCs分化生長的情況。
　　 (4)成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的檢測
　　 分別將第3代MSCs在含有含藥血清(A組)、無藥血清(B組)和胎牛血清(C組)的誘導礦化液+DMEM中培養(yǎng)。檢測成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性。
　　 2補腎壯骨中藥血清對成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響
　　 將第3代MSCs在含

9、有含藥血清(A組)、無藥血清(B組)和胎牛血清(C組)的誘導礦化DMEM中培養(yǎng)。采用原位雜交的方法檢測成骨細胞OPG和RANKL rnRNA的表達情況。
　　 3頜骨牽張成骨過程中補腎壯骨中藥對成骨質(zhì)量和骨鈣素的影響
　　 選用16只Beagle犬隨機分為中藥組和對照組,所有動物行右側(cè)下頜骨劈開后植入常規(guī)組合式骨牽張器,經(jīng)7天延遲后,以0.5mm/12h的牽張速度,連續(xù)10天。中藥組動物自牽張器植入術(shù)后第一天口服補腎壯骨

10、中藥至實驗結(jié)束。分別于固定1周、2周、3周、4周后每組處死2只Beagle犬,留取標本后進行組織學觀察、骨組織計量學分析及骨鈣素的檢測。
　　 結(jié)論
　　 1補腎壯骨中藥能明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化增殖,提高成骨細胞的活性。
　　 2補腎壯骨中藥可以調(diào)節(jié)成骨細胞分泌OPG、RANKL的功能,從而降低破骨細胞的活力,促進成骨過程,提高骨密度。
　　 3補腎壯骨中藥在體內(nèi)能有效地加速下頜骨牽張過程