氯丙嗪單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞生長的研究.pdf

1、目的 宮頸癌(cervical carcinoma)是女性最常見的一種惡性腫瘤，它的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第二位。傳統(tǒng)的治療方法是早期手術(shù)，放療為主，化療為晚期或復(fù)發(fā)患者的治療方法。手術(shù)僅適于早期患者且創(chuàng)傷大，而放療后女性內(nèi)分泌功能受到損害，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降尤其是年輕女性患者。傳統(tǒng)的化療藥物有不同程度的毒副作用并出現(xiàn)腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥反應(yīng)，最終導(dǎo)致治療失敗。隨著宮頸癌發(fā)病的年輕化和腺癌比例增加，患者對(duì)治療后

2、生活質(zhì)量的要求更加提高。因此尋找一些毒性小、藥物反應(yīng)少且有一定療效的藥物治療宮頸癌，或者利用它們?cè)黾踊熕幬锏拿舾行跃惋@得極其重要。本研究旨在研究氯丙嗪(Chlorom-azine)單獨(dú)及與順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)聯(lián)合用藥對(duì)人宮頸癌hela細(xì)胞株體外生長的影響，以期為臨床上藥物治療宮頸癌提供新思路。 方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)方法復(fù)蘇凍存于液氮罐中的人宮頸癌hela．細(xì)胞

3、，接種于含10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞生長至70％融合時(shí)(約2—3天)，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以備實(shí)驗(yàn)用。 2、采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colofimetricassay,MTT)比色法檢測氯丙嗪、順鉑單獨(dú)用藥及氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)該細(xì)胞增殖的影響，測定吸光度(OD)值。流式細(xì)胞儀(FCM)測定氯丙

4、嗪單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)hela細(xì)胞周期分布和凋亡的影響；流式細(xì)胞儀間接免疫熒光技術(shù)分析氯丙嗪單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合用藥后hela細(xì)胞bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測聯(lián)合用藥后2小時(shí)及4小時(shí)后bcl-2、Bax mRNA表達(dá)量的改變。以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠掃描儀進(jìn)行DNA電泳條帶的光量子強(qiáng)度分析，分別將bcl-2、Bax/β-actin作為bcl-2、Bax mRNA表

5、達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)bcl-2、Bax產(chǎn)物相對(duì)定量。 3、采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(IteractionIndex)，評(píng)價(jià)聯(lián)合后的作用。如果相互作用指數(shù)>1，為兩藥拮抗作用：相互作用指數(shù)=1，為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)<1，為兩藥協(xié)同作用。 結(jié)果 1、MTT比色法顯示氯丙嗪、順鉑單獨(dú)用藥，濃度分別為(1×10<'-4>、1×10<'-5>、1×10<'-5>mol/L)對(duì)hela細(xì)胞均

6、具有抑制增殖作用。不同濃度的氯丙嗪及順鉑處理細(xì)胞24-72h后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。且隨著藥物濃度的增大、作用時(shí)間的延長，OD值逐漸下降。上述結(jié)果表明，氯丙嗪及順鉑對(duì)hela細(xì)胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量.效應(yīng)和時(shí)間.效應(yīng)依賴關(guān)系。 2、氯丙嗪(1×10<'-6>mol/L)與順鉑(1×10<'-4>、1×10<'-5>、1×10<'-6>mol/L)聯(lián)合用藥作用hela

7、細(xì)胞24-72小時(shí)后，與對(duì)照組相比，OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與順鉑單獨(dú)處理組相比，OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。且隨著順鉑濃度的增大、作用時(shí)間的延長，OD值逐漸下降。上述結(jié)果表明，氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)hela細(xì)胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量一效應(yīng)和時(shí)間.效應(yīng)依賴關(guān)系，推測兩者之間有相互協(xié)同作用。 3、流式細(xì)胞儀檢測hela細(xì)胞周期分布和凋亡顯示：氯丙嗪單獨(dú)及聯(lián)合用藥24小時(shí)

8、后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多；S期和G2/M期細(xì)胞則逐漸減少。且出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依濃度的增大而逐漸升高，凋亡百分率氯丙嗪組為32.97％：聯(lián)合用藥組分別為54.71％、65.11％。上述結(jié)果表明，氯丙嗪單獨(dú)及聯(lián)合用藥24小時(shí)后可阻滯hela細(xì)胞周期進(jìn)程于G1期，該作用呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，并且hela細(xì)胞凋亡百分率依濃度的增大而逐漸增加。 4、流式細(xì)胞儀間接分析細(xì)胞bcl-2、Bax蛋白表達(dá)顯示：含終濃

9、度為10<'-6>mol/L的氯丙嗪單獨(dú)及與含終濃度為10<'-5>、10<'-4>mol/L的順鉑聯(lián)合用藥24小時(shí)后bcl-2的熒光指數(shù)FI值隨處理組濃度增大而逐漸減少，Bax的熒光指數(shù)FI值隨處理組濃度增大而逐漸增大。對(duì)于每一種蛋白，比較其處理組和對(duì)照組的FI值，差異具有顯著性(p<0.05)。表明，氯丙嗪單獨(dú)及聯(lián)合用藥后hela細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。 5、RT-PCR結(jié)果示：聯(lián)合用藥前后bcl-2

10、、Bax的mRNA表達(dá)量均改變，bcl-2的表達(dá)水平隨處理組時(shí)間的延長而逐漸減少，Bax的表達(dá)水平隨處理組時(shí)間的延長而逐漸增大。用藥前后bcl-2、Bax/β-actin比值對(duì)bcl-2、Bax產(chǎn)物相對(duì)定量，進(jìn)行對(duì)比，有顯著差異(p<0.05)。表明，聯(lián)合用藥后hela細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax mRNA表達(dá)上調(diào)。 6、isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)顯示：氯丙嗪聯(lián)合順鉑在細(xì)胞生長抑制率為50％時(shí)

11、相互作用指數(shù)小于1。表明，氯丙嗪與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)hela細(xì)胞的增殖抑制有協(xié)同作用。 結(jié)論 1、本試驗(yàn)首次通過體外試驗(yàn)證實(shí)氯丙嗪單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)hela細(xì)胞的生長有抑制作用。兩藥聯(lián)合應(yīng)用為協(xié)同作用，對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞的增殖有抑制作用且作用呈時(shí)間一劑量依賴關(guān)系。聯(lián)合用藥與順鉑單獨(dú)用藥的抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者有顯著的差異(p<0.05)，證實(shí)氯丙嗪有體外輔助化療的作用，亦可增加順鉑的敏感性。 2、本試驗(yàn)證

12、實(shí)氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥可阻滯宮頸癌細(xì)胞hela于G1期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。 3、我們通過流式檢測可初步推論氯丙嗪單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合用藥均可下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，通過RT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步推測兩藥聯(lián)合應(yīng)用后下調(diào)bcl-2基因的表達(dá)和上調(diào)Bax基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。 4、本試驗(yàn)證實(shí)了氯丙嗪這一臨床常用的抗精神失常藥在體外具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，與順