腦膠質瘤干細胞對化療藥物體外敏感試驗的研究.pdf

1、背景與目的:腦膠質瘤是顱內腫瘤中最常見的一型,占到顱內腫瘤的35％~51％。近幾年來,雖然顱內腫瘤的診療手段不斷提高,同時腦膠質瘤的分子、基因方面的研究也有了很大進展,但對惡性膠質瘤的治療并沒有重大突破,患者的預后欠佳,惡性膠質瘤患者大多數(shù)(約占77％)在確診后1年內死亡。目前治療腦膠質瘤的主要方法仍是以手術治療、放射治療、藥物治療等組成的綜合治療體系。因此,如何立足于現(xiàn)有的治療技術,提高顱內腫瘤特別是腦膠質瘤的治療效果,延長病人生存時

2、間,提高病人的生活質量就成為當今神經外科亟待解決的難題。隨著對腫瘤研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn):在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中,僅有一小部分腫瘤細胞(即腫瘤干細胞)具有廣泛的增殖和自我更新能力,而大多數(shù)腫瘤細胞從發(fā)生起始,就逐步進入分化、成熟甚至衰老階段,缺乏或是漸漸失去增殖及自我更新的能力,僅有腫瘤形態(tài)學上的外在表現(xiàn)。繼從白血病和乳腺癌中成功分離出具有干細胞特性的腫瘤細胞之后,腦膠質瘤干細胞的存在也得以確證。腦膠質瘤內存在有性質與神經干細胞

3、相似的細胞,這些細胞在體外無血清培養(yǎng)基中可形成腫瘤球,具有自我更新、異常的增殖及多向分化潛能,且細胞比例與原腫瘤相似,可能參與了腦膠質瘤的形成。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn):該類細胞陽性表達人類干細胞標志物CD133,可從實體膠質瘤中分離,即腦膠質瘤干細胞(braingiloma stem cell,BGSC)。將此類細胞以100個為量接種入NOD-SCID鼠腦,觀察3-6個月后,可見鼠腦內長出新生腫瘤,且表型與親代腫瘤相似。針對腦膠質瘤

4、干細胞進行靶向治療,為人腦膠質瘤的治療方法提出了新的思路?，F(xiàn)今治療顱內腫瘤的常用手段是:在神經安全的前提下最大范圍的切除腫瘤組織,并聯(lián)合術后有效的放化療。選擇合適的、敏感性高的化療藥物可有助提高手術和放療的效果,改善病人生活質量,延長生存期。近年來,個體化治療成為腫瘤治療的主導趨勢,化療前進行體外藥敏試驗排除無效藥物,篩選敏感藥物,并根據(jù)患者具體情況制定個體化的化療方案,避免特異性不強的化療藥物給患者造成毒副作用,可最終達到提高臨床化療

5、效果并節(jié)省醫(yī)療費用的目的。結合上述學說和臨床實際,進行本實驗設計。在腦膠質瘤中分離,培養(yǎng)及鑒定BGSC,選用替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸、順鉑四種化療藥物,對腦膠質瘤干細胞進行體外藥物敏感試驗。替莫唑胺,一種治療腦膠質瘤的新型口服化療藥物,是一種新型咪唑四嗪類,具有吸收完全,可通過血腦屏障,達血藥峰濃度較快等優(yōu)點;雷帕霉素,一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑,主要用于治療白血病,近期發(fā)現(xiàn)還具有抗腫瘤的作用;亞砷酸,是我國傳統(tǒng)中藥砒

6、霜的主要成分,還未見有臨床治療腦膠質瘤的報道;順鉑,是臨床一線化療藥物。通過觀察各種藥物對細胞生長抑制率變化情況,分析其對各藥物敏感程度,進一步驗證體外藥敏試驗對膠質瘤化療的指導意義,為臨床應用提供依據(jù)。
　　材料與方法:在無菌條件下,手術中切除并通過病理檢驗證實的Ⅱ-Ⅳ級的膠質瘤標本,PBS充分沖洗后,經膠原酶及胰酶消化為單細胞懸液,以2×10~5個/ml濃度接種于含有生長因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在相差倒置顯微鏡下觀察其生長情

7、況,并利用細胞免疫組化法檢測Nestin和GFAP的表達,細胞免疫熒光法檢測CD133的表達,流式細胞儀檢測細胞周期。在鑒定所培養(yǎng)的細胞確為腦膠質瘤干細胞后,分別將替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑以不同濃度[血藥峰濃度(μg/ml)ppc(plasma pleak concentration)](10ppc,5ppc,1.0ppc,0.5ppc,0.1ppc,0ppc),作用于體外培養(yǎng)的人腦膠質瘤干細胞,0ppc作為空白對照,用MTT法

8、檢測細胞生長抑制率,相差倒置顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)學變化,采用Caspase-3免疫組化試劑盒檢測細胞凋亡,采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對抑制率進行單因素的方差(One MayANOVA)分析,以檢驗各藥物作用后對細胞生長的抑制率間差異有無統(tǒng)計學意義,利用最小顯著差法(LSD)進行多重比較。
　　結果:腦膠質瘤組織中確實存在腦膠質瘤干細胞,并能在體外分離、培養(yǎng);將單細胞懸液種植在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24~48h后可形成大小不一,折光性較強

9、,懸浮生長的腫瘤干細胞球;培養(yǎng)4~5d后傳代,可形成次代腫瘤干細胞球,且數(shù)量增多,體積增大,形狀規(guī)則,腫瘤干細胞球和細胞形態(tài)與原代無異。免疫熒光化學染色CD133和免疫組織化學染色Nestin及GFAP陽性表達;用流式細胞儀對BGSC進行細胞周期分析,證實其具有干細胞的典型周期特性,即大部分細胞處于G0/G1期,只有少數(shù)細胞處于S期。腦膠質瘤干細胞在體外可進行誘導分化,在倒置相差顯微鏡下觀察可見,細胞由周邊開始向外側分化生長,呈條梭狀,

10、形態(tài)似人腦膠質瘤細胞系。不同濃度的替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸和順鉑對13例膠質瘤干細胞有其相應的不同抑制率。替莫唑胺,1ppc時,對BGSC作用72h和48h時的細胞增殖抑制率分別為(64.3±1.7)％和(24.1±2.4)％,72h的細胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);雷帕霉素,1ppc時,對BGSC作用72h和48h時的細胞增殖抑制率分別為(37.8±0.4)％和(29.1±0.6)％,72h的細胞抑制率升高明

11、顯,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);亞砷酸,1ppc時,對BGSC作用72h和48h時的細胞增殖抑制率分別為(62.6±3.0)％和(40.5±2.2)％,72h的細胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);順鉑,1ppc時,對BGSC作用72h和48h時的細胞增殖抑制率分別為(63.5±1.3)和(32.7±1.7)％,72h的細胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,

12、替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸、順鉑四種化療藥物對BGSC增殖抑制率逐漸增高,呈時間-劑量效應。當藥物濃度均為為1ppc時,作用24h后,亞砷酸對膠質瘤干細胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);當藥物濃度均為為1ppc時,作用48h后,亞砷酸對膠質瘤干細胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),順鉑對膠質瘤干細胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05

13、);當藥物濃度均為為1ppc時,作用72h后,替莫唑胺、亞砷酸及順鉑對膠質瘤干細胞的抑制作用優(yōu)于雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑對13例標本中每1例的抑制率都不相同,且依據(jù)組織來源不同表現(xiàn)出個體化的差異。腫瘤干細胞經替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑處理后,其形態(tài)發(fā)生改變,大量細胞從聚集的細胞團周圍分離開,散在于培養(yǎng)基中,其折光性減弱。利用免疫組化技術檢測Caspase-3在用藥后的細胞中的表

14、達情況,可見有陽性表達,提示凋亡過程中有Caspase-3酶原蛋白的激活。
　　結論:1.膠質瘤組織中可以分離出表達干細胞標記物CD133、Nestin的腫瘤干細胞,并可在體外進行培養(yǎng),具有自我更新和克隆增殖的能力。
　　2.替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑對不同來源的膠質瘤干細胞具有其相應的抑制率。上述4種藥物對膠質瘤干細胞平均抑制率具有量-效與時-效關系,即隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長,對細胞的抑制率增加。但不同藥