海洋生物來源新化合物SD118-2抗肝癌細胞HepG2作用及機制研究.pdf

1、由于對海洋生物資源的不斷開發(fā)及利用，科研學者們在這十年當中逐步的發(fā)現(xiàn)了一些新型的具有抗癌作用價值的臨床藥物。比如海洋微生物類藥物Eribulin就是一種通過抑制微管動力學起作用的化合物，它通過與癌細胞微管蛋白結合來抑制有絲分裂的發(fā)生，從而觸發(fā)癌細胞凋亡機制發(fā)揮抗癌效應。本實驗當中所運用的化合物SD118-2(結構式：C18H12N2O2)就是從深海沉積物中提取出來的，它除了具有抗菌的活性以外，在體外還能抑制多種癌細胞的增殖。
　　

2、 第一部分SD118-2對人肝癌HepG2細胞增殖，周期和凋亡的影響
　　 目的：為了檢測化合物SD118-2對肝癌細胞HepG2的增殖效應以及對細胞周期和凋亡的影響。
　　 實驗方法：以正常的人類肝臟細胞L02為參照測定化合物SD118-2對人類肝癌細胞HepG2的半數(shù)抑制濃度IC50。通過計算IC50得出的結果為參考濃度作用于肝癌細胞，然后通過流式細胞分析儀檢測細胞周期及細胞凋亡的情況。
　　 結果：MTT

3、結果顯示SD118-2作用于HepG2細胞48h后可明顯抑制細胞增殖，其作用具有濃度依賴性，但對人正常肝細胞L02顯示出較低的毒性，通過計算得到半數(shù)抑制濃度IC50為24.3μM，以此濃度為化合物的指導濃度用于HepG2細胞來檢測后續(xù)的實驗。流式細胞分析儀對細胞周期及細胞凋亡進行檢測，結果顯示化合物SD118-2對HepG2細胞周期的影響不明顯，運用統(tǒng)計學方法處理后發(fā)現(xiàn)沒有顯著的統(tǒng)計學意義。而檢測出的細胞凋亡數(shù)也不多，凋亡率不到7％。隨

4、后運用了透射電子顯微鏡技術對化合物作用HepG2后的形態(tài)學進行觀察，發(fā)現(xiàn)為數(shù)不多的凋亡細胞，意外的發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞質中有自噬體的存在，自噬體內還包含有殘余的細胞器。
　　 結論：化合物SD118-2對細胞增殖具有明顯的抑制作用，但對HepG2細胞周期的改變并不明顯，對細胞凋亡的影響也不顯著?；衔颯D118-2通過其它作用方式來影響細胞的增殖效應。
　　 第二部分SD118-2誘導肝癌細胞HepG2產(chǎn)生自噬及對信號通

5、路的影響
　　 目的：進一步研究化合物SD118-2誘導肝癌細胞HepG2產(chǎn)生自噬的過程，明確產(chǎn)生自噬的信號通路。
　　 實驗方法：形態(tài)學方面是通過透射電子顯微鏡來觀察自噬體的存在；生物化學方面是通過RT-PCR在mRNA水平檢測自噬相關基因的表達；通過westernblotting技術在蛋白水平驗證自噬相關蛋白的表達以及明確化合物SD118-2對自噬信號通路的影響。
　　 結果：SD118-2作用HepG2后通

6、過電鏡觀察不同時間段的自噬溶酶體；在mRNA水平以Actin為內參，檢測到了自噬相關基因Beclin1與LC3高度上調，并具有時間依賴性；在蛋白水平也證明了自噬相關蛋白Beclin1的高表達以及自噬特異性蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化；在對自噬信號通路的研究中我們發(fā)現(xiàn)，以β-actin為內參，藥物組與對照組相比，總的mTOR水平改變不明顯，而磷酸化的mTOR、p-ERK1/2及Bcl-2都隨著化合物作用時間的延長而減少。
　　

7、 結論：SD118-2誘導HepG2細胞產(chǎn)生自噬是通過抑制MEK/ERK-mTOR信號通路和增強Ⅲ型PI3K/Beclin1信號通路所產(chǎn)生的。
　　 第三部分3-MA抑制后SD118-2的生物學效應
　　 目的：通過運用特異性自噬抑制劑3-MA減少自噬后，觀察化合物SD118-2作用HepG2后的效果。
　　 實驗方法：westernblotting檢測添加3-MA后自噬蛋白的變化；通過流式細胞分析儀檢測添加3-

8、MA后對凋亡的影響；通過MTT法檢測添加3-MA后細胞增殖情況。
　　 結果：添加自噬抑制劑3-MA后，凋亡的變化沒有統(tǒng)計學意義；而蛋白水平的結果顯示自噬特異性蛋白Beclin1的表達大幅度減弱，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化也減少了很多；MTT結果顯示當添加3-MA后，細胞生存率增加，具有明顯的統(tǒng)計學意義。
　　 結論：當運用自噬抑制劑3-MA后，凋亡率不穩(wěn)定，這就說明了在本實驗當中，化合物SD118-2作用于HepG2

9、細胞誘導產(chǎn)生的自噬與凋亡之間沒有直接關系。通過westernblotting技術，我們證實了3-MA減弱了自噬相關蛋白的表達。MTT實驗的結果說明了SD118-2誘導HepG2產(chǎn)生的自噬可以引起自噬性細胞死亡。
　　 綜上所述，從深海沉積物中提取出來的化合物SD118-2在體外能抑制多種癌細胞的增殖。我們的研究發(fā)現(xiàn)化合物SD118-2作用于HepG2不引起明顯的細胞凋亡，能使大部分幸存細胞誘導產(chǎn)生自噬，所被誘導產(chǎn)生的細胞自噬是通