惡黑細胞中的谷氨酸信號通路及其與細胞骨架蛋白分子的作用機制.pdf

1、目的： 研究惡黑細胞中的谷氨酸信號通路及其與細胞骨架蛋白分子的作用機制。 方法： 1.微管相關(guān)蛋白2a(Microtubule-associated protein 2a，MAP2a)、離子型谷氨酸受體中的甲基-D-天冬氨酸受體 2A(N-methyl-D-aspartate receptors 2A，NMDAR2A)、代謝型谷氨酸受體1(metabotropic glutamate receptor 1，mGl

2、uR1)在人類侵襲性惡黑細胞WM451LU細胞中的亞細胞分布差異研究：培養(yǎng)人胚腎細胞系HEK293細胞、WM451LU細胞；在HEK293細胞中擴增重組腺病毒-微管相關(guān)蛋白2a(adenovims-mediated MAP2a,Ad-MAP2a)；對WM451LU細胞MAP2a基因轉(zhuǎn)染后進行免疫熒光雙重染色及倒置熒光顯微鏡下觀察WM451LU細胞中MAP2a、NMDAR2A及mGluR1的細胞內(nèi)分布；進一步在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察W

3、M451LU細胞中MAP2a與NMDAR2A及mGluR1的亞細胞分布。 2.上調(diào)MAP2a表達及神經(jīng)保護化學(xué)藥干預(yù)對WM451LU細胞形態(tài)的影響觀察：觀察轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a、NMDAR非競爭性拮抗劑MK-801以及選擇性的非競爭性mGluR1拮抗劑CPCCOEt分別作用下，WM451LU細胞中α-微管蛋白(α-tubulin)的分布、密度以及細胞形態(tài)的變化。在原子力顯微鏡下觀察上調(diào)MAP2a表達、MK-801及CPCCOEt

4、分別及協(xié)同作用下WM451LU細胞樹突形態(tài)的影響。 3.轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a對WM451LU細胞內(nèi)NMDAR2A及mGluR1蛋白表達水平的影響：通過流式細胞儀及Western Blot方法測定轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后WM451LU細胞內(nèi)NMDAR2A及mGluR1的表達。 4　觀察CPCCOEt及MK-801對WM451LU細胞生長的影響。 結(jié)果： 1.研究發(fā)現(xiàn)在人類侵襲性惡黑細胞WM451LU細胞中有N

5、MDAR2A及mGluR1的表達。NMDAR2A及mGluR1與微管相關(guān)蛋白MAP2a在WM451LU細胞中具有相同的亞細胞定位：均分布于細胞漿內(nèi)，并且主要位于細胞樹突內(nèi)。 2.轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后WM451LU細胞內(nèi)α-tubulin的密度明顯增加，細胞的樹突明顯增長，并且α-tubulin主要位于增長的細胞樹突內(nèi)。在谷氨酸受體拮抗劑MK-801及CPCCOEt作用下WM451LU細胞內(nèi)α-tubulin的密度明顯增大，細胞

6、的樹突纖細而狹長，明顯不同于陰性對照組細胞短而粗的細胞樹突，且α-tubulin主要分布于纖細、狹長的細胞樹突內(nèi)。 3.MK-801單獨以及與MAP2a協(xié)同作用下WM451LU細胞恢復(fù)樹突化，其中以二者協(xié)同作用下細胞形態(tài)的改變更為顯著，細胞樹突明顯延長，出現(xiàn)大量二級、三級細胞樹突，呈現(xiàn)出與正常黑色素細胞所特有的細胞形態(tài)極其相似的細胞形態(tài)。 4　轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后NMDAR2A及mGluR1的表達量無明顯變化。

7、 5 MK-801及CPCCOEt對人類侵襲性惡黑細胞WM451LU細胞增殖具有顯著抑制作用。 結(jié)論： 1.WM451LU細胞中有NMDAR2A及mGluR1的表達，且其亞細胞分布與MAP2a一致。 2.MK-801以及CPCCOEt具有誘導(dǎo)WM451LU細胞樹突形成的作用，并可使WM451LU細胞樹突內(nèi)的微管蛋白密度增加。 3.MK-801單獨以及與MAP2協(xié)同作用下可誘導(dǎo)WM451LU細胞樹突形成，使