蚊核糖體蛋白L39基因克隆及初步功能的研究.pdf

1、媒介昆蟲嚴重危害人類健康，據估計傳染病中2/3由媒介昆蟲傳播。世界史上許多危害嚴重的蟲媒傳染病如鼠疫、斑疹傷寒、黃熱病、瘧疾等都曾造成廣泛的流行并奪去成千上萬人的生命。當今世界隨著人類交往的日益頻繁，發(fā)現許多新的和重新出現的蟲媒傳染病?；瘜W防治一直是媒介綜合治理的主要方法。殺蟲劑的大量、連續(xù)使用導致了媒介抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前，世界范圍內至少已有504種昆蟲產生了抗藥性，包括主要的媒介昆蟲，其中109種(亞種)蚊對一種或多種殺蟲劑產生

2、了抗性。殺蟲劑抗性直接影響著蟲媒傳染病的流行和重新流行，因此，研究媒介抗藥性產生的機制并進行適宜治理實乃當務之急。本研究擬從克隆抗藥性相關基因入手，并對其進行功能鑒定，繼而研究其下游蛋白質組學，為探討最終治理媒介抗藥性奠定基礎。為此，本文進行了以下幾個方面的研究。 一、淡色庫蚊核糖體蛋白L39基因的分子克隆、序列分析及表達差異鑒定 為克隆淡色庫蚊核糖體蛋白L39基因并對其進行表達差異的鑒定，本研究采用RT-PCR技術和c

3、DNA末端快速擴增(RACE)策略，從淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)對溴氰菊酯抗性品系4齡幼蟲中克隆核糖體蛋白L39基因(RPL39)，用相應的軟件進行生物信息學分析，并用熒光定量PCR和半定量RT-PCR分析敏感、抗性品系蚊的RPL39表達水平及對蚊各期RPL39進行表達差異鑒定。結果表明，成功克隆出RPL39基因。RPL39基因全長508bp，開放閱讀框為156bp，編碼51個氨基酸(GenBank/NCBI

4、 DQ080075)。序列分析顯示，該基因在各物種中保守性很高，與已報告的岡比亞按蚊(Ahophelesgambiae)核糖體蛋白L39基因(GenBank/NCBI XP 320713)有99％同源性，并具有一個經典的核糖體蛋白L39結構域，沒有跨膜區(qū)域，無信號肽序列，屬于胞漿蛋白。熒光定量PCR結果表明，RPL39在淡色庫蚊對溴氰菊酯抗性品系中表達水平高于敏感品系，提示RPL39基因可能與對殺蟲劑的抗藥性相關。RPL39 mRNA在

5、淡色庫蚊抗性/敏感品系各個發(fā)育階段也有不同的表達，以雌性成蚊表達差異最大。 二、淡色庫蚊核糖體蛋白L39基因的初步功能研究 為鑒定核糖體蛋白L39基因與淡色庫蚊溴氰菊酯抗性的關系，本研究擴增RPL39基因編碼區(qū)，構建蚊細胞表達載體pIB/V5-His/RPL39，轉染蚊C6/36細胞。稻瘟菌素穩(wěn)定篩選和單克隆化后，細胞擴大培養(yǎng)，然后用RT-PCR和Western blot鑒定穩(wěn)定轉基因細胞的轉錄表達。不同濃度的溴氰菊酯處

6、理穩(wěn)定轉基因細胞及對照未轉基因細胞和轉無關基因細胞后，用<'3>H-TdR測定細胞生存率法、細胞生長曲線測定及顯微鏡下觀察細胞存活率、細胞增殖速度及細胞生長情況等。結果顯示，成功構建昆蟲細胞表達載體并建立穩(wěn)定轉染細胞系，RT-PCR和Western blot檢測重組表達載體(pIB/V5-His/RPL39)在穩(wěn)定轉染的蚊細胞內高表達。不同濃度的溴氰菊酯處理轉染細胞后，在藥物壓力下，轉染核糖體蛋白L39目的基因細胞組的EC50顯著高于轉

7、染無關基因CAT細胞組和未轉染空細胞組(p<0.05)。細胞的增值速度也快于對照細胞；轉染RPL39基因細胞的形態(tài)、密度未見明顯變化，而對照細胞顆粒變粗、密度降低。初步研究結果提示，RPL39基因與溴氰菊酯抗性相關，可能為溴氰菊酯抗性相關基因。 三、淡色庫蚊核糖體蛋白L39下游蛋白質組學的初步研究 為探討核糖體蛋白L39 的抗藥性作用機制及與其他蛋白質的相互作用，采用對轉染核糖體蛋白L39基因細胞進行二維電泳和質譜鑒定的方

8、法，對表達有差異的蛋白質點進行鑒定。實驗結果提示，轉染核糖體蛋白L39基因的細胞高表達一系列與其他物種的各種酶高度同源的蛋白，例如酚氧化酶前體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白磷酸酶、精氨酸琥珀酸鹽移解酶、酪氨酸磷酯酶、以及具有降解多種藥物功能的多藥耐藥蛋白等；轉染細胞還高表達一系列和其他物種轉錄調控相關的蛋白高度同源的蛋白，例如 ATP結合轉錄亞家族B、跨膜GTP酶、DNA復制準許因子、轉錄子的穩(wěn)定期調節(jié)蛋白、反轉錄轉