RhoA-ROCK通路在PET編織材料介導小鼠BMSC遷移中的作用.pdf

1、研究背景
　　關節(jié)韌帶損傷在日常生活中較為常見,據(jù)統(tǒng)計在美國每年約有6‰的人發(fā)生前十字韌帶損傷,其中約半數(shù)需要手術重建。隨著現(xiàn)代關節(jié)外科的迅速發(fā)展,對人工韌帶材料的安全性和生物替代性的相關研究已成為目前關注的熱點問題,而材料介導下細胞的遷移是材料對細胞其它生物學功能影響的基礎。
　　人工材料的生物替代過程依賴于其對植入?yún)^(qū)生物細胞遷移的誘導性能,這是生物材料對細胞生物學功能產(chǎn)生影響的前提基礎。體內(nèi)細胞的遷移過程需經(jīng)歷四個步驟:

2、細胞首先通過與細胞外基質(zhì)(ECM)建立新的粘附連接,使細胞與ECM相固定,之后細胞前端沿遷移方向伸出片狀偽足,并與前方ECM粘附以維持伸張狀態(tài),隨后細胞內(nèi)的肌動蛋白、肌球蛋白發(fā)揮作用調(diào)節(jié)細胞體的收縮,促使細胞向前運動,最后細胞尾部與ECM分離并通過收縮將尾部抬起向前,完成遷移過程。大量研究表明,因生物材料本身性質(zhì)的不同,以及生物支架工程設計的不同,對細胞生長、遷移等多種生物學功能均有一定影響。這提示我們,通過研究材料的生物學效應和生物支

3、架空間結構與細胞學之間的關系,將有助于進一步提高材料的生物安全性和生物替代性,為臨床疾病的治療提供更好的手段。
　　以聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維為原料研制的人工韌帶是目前關節(jié)外科修復重建損傷韌帶的重要材料。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)PET人工韌帶材料經(jīng)殼聚糖接枝改性后生物相容性和浸潤性大大提高,提示改性后的新型PET材料具有作為人工韌帶的良好潛質(zhì),但將其編織物對細胞的生物學行為的影響尚待深入研究。人工韌帶在植入后,骨髓間充質(zhì)干細胞

4、(BMSC)是植入?yún)^(qū)的主要細胞之一,其可在應力作用下完成細胞定向分化,而BMSC向人工韌帶的遷移過程受材料編織物的微孔結構、張力和生物相容性等諸多因素影響。因此,研究細胞在生物材料上的遷移能力及相關機制具有重要意義。
　　Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶,是介導多種細胞生物學功能的重要分子信號通路之一,也是整合多種細胞內(nèi)信號通路的共同信號分子,具有分子開關的作用。研究表明Rho家族在細胞骨架、基因轉(zhuǎn)錄、細胞粘附的調(diào)控及多條信號通路的調(diào)

5、節(jié)中的調(diào)控作用不可或缺。Rho家族作為Ras超家族成員,是MAPK系統(tǒng)上游的一類重要的信號轉(zhuǎn)導分子,其中對RhoA、Cdc42和Rac3個成員的主要作用機制研究相對明確。而RhoA在細胞遷移過程中發(fā)揮了非常重要的作用,它所介導的RhoA/ROCK通路被稱為是細胞運動的“動力馬達”。
　　RhoA為單體G蛋白,結構序列相對保守。RhoA受固有的激活機制調(diào)控,RhoGTPases以無活性的結合GDP形式或有活性的結合GTP形式存在,通

6、過兩者間的相互轉(zhuǎn)換發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。RhoA活化后通過激活下游效應分子ROCK來啟動通路。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,其激活后可以對下游底物進行磷酸化。在細胞遷移時,ROCK活化后可以對下游底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(Myosinlightchainphosphatase,MLCP)進行磷酸化,或者直接對肌球蛋白輕鏈磷酸化。通過這兩種途徑增加了細胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平,刺激了由肌球蛋白和肌動蛋白的交聯(lián),增強了肌動蛋白收縮。ROCK還

7、可以激活LIM激酶,LIM激酶激活后可使肌動蛋白解聚和切割因子失活。此外,ROCK還能激活絲切蛋白,從而增加和穩(wěn)定了肌動蛋白絲。以上述信號通路的共同作用為核心,最終引起細胞發(fā)生遷移。
　　目的
　　1.建立可應用于體外細胞在生物材料編織物上遷移的模型;
　　2.RhoA/ROCK信號通路在PET編織物介導小鼠BMSC遷移中的影響;
　　方法
　　1.利用醫(yī)用316L不銹鋼設計制作細胞遷移模具,置于六孔板,在

8、模具加樣孔內(nèi)接種小鼠BMSC,培養(yǎng)24h后撤出模具,分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h;
　　2.在證實模具可有效用于量化細胞遷移過程后,將不同線密度經(jīng)改性的PET材料編織物平鋪于六孔板底,利用本模型觀察BMSC在3000D組和5000D組材料編織物上的遷移能力,吉姆薩染色法計算不同時間點BMSC的遷移面積;
　　3.建立在PET材料編織物上培養(yǎng)的小鼠BMSC的遷移模型,依材料不同分為3000DA編織方法組、3000DB編織

9、方法組、5000DA編織方法組和5000DB編織方法組,分別培養(yǎng)96h后采用吉姆薩染色法和Westernblot法觀察細胞的遷移過程及RhoA蛋白的表達變化;
　　4.用濃度分別為0、5、10、20μmol/L的ROCK激酶抑制劑Y27632處理小鼠BMSC,在5000DA編織方法PET材料上培養(yǎng)96h,利用吉姆薩染色法和Westernblot法觀察細胞遷移的快慢及其對RhoA、ROCK和p-MLC蛋白表達的影響。
　　結果

10、
　　1.細胞接種24h后取出模具,見六孔板底中央?yún)^(qū)出現(xiàn)與模具底面大小相當?shù)臒o細胞區(qū)。隨培養(yǎng)時間延長,BMSC逐漸由周圍向中央?yún)^(qū)域遷移;
　　2.在經(jīng)改性的PET材料編織物上成功建立細胞遷移模型后,吉姆薩染色提示,隨培養(yǎng)時間增加,兩組細胞遷移面積均逐漸增大,其中3000D組細胞遷移面積顯著大于5000D組(P<0.05);
　　3.吉姆薩染色法發(fā)現(xiàn),5000DA編織方法組細胞遷移面積明顯優(yōu)于其余3組(P<0.05),3

11、000DA編織方法組次之,5000DB編織方法組優(yōu)于3000DB編織方法組。Westernblot結果提示RhoA蛋白表達量的變化趨勢與吉姆薩染色相同;
　　4.在5000DA編織方法的PET編織物上建立細胞遷移模型,應用ROCK激酶抑制劑Y27632后,吉姆薩染色及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),隨Y27632抑制劑濃度增高,其細胞的遷移面積逐漸減小,RhoA蛋白、ROCK蛋白和p-MLC蛋白表達量下降(P<0.05)。