PI3K-Akt信號通路對DNA甲基轉移酶3B基因表達的調控及其分子機制研究.pdf

1、腫瘤細胞表現(xiàn)廣泛而顯著的表觀遺傳學變化，包括DNA甲基化和染色質修飾。DNA甲基化是最廣為人知的表觀遺傳學標志，DNA甲基化主要由DNA甲基轉移酶(DNA(cytosine-5)-methyltransferases，DNMTs)(EC2.1.1.37)所控制。目前，已鑒定的人類具有催化活性的DNMTs有三種：DNMTl，DNMT3A和DNMT3B，其編碼基因分別位于染色體19p13.2.、2p23和20q11.2。DNMT1優(yōu)先選擇D

2、NA復制過程中所形成以半甲基化狀態(tài)存在的DNA雙鏈作為催化底物，而DNMT3A和DNMT3B是從頭(de novo)DNA甲基化修飾所必須的，主要為在細胞內建立新DNA甲基化類型所必須。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中存在異常DNA甲基化類型，即廣泛的DNA低甲基化與某些基因啟動子特異高甲基化。發(fā)生在啟動子CpG島高甲基化可影響許多與腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展密切相關基因的表達，在惡性腫瘤以及在癌旁組織向惡性狀態(tài)轉變過程中均發(fā)現(xiàn)DNMTs升高。有學者認為具有

3、從頭DNA甲基化作用的DNMT3B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有更重要作用。在細胞內PI3K/Akt信號通路調控眾多信號轉導途徑，例如細胞生長與存活、細胞間信息傳遞等。異常PI3K/Akt信號通路參與腫瘤形成與轉移。我們實驗室已報道PI3K/Akt信號通路可以維持DNMT1蛋白穩(wěn)定性，從而在腫瘤發(fā)生中起促進作用，但PI3K/Akt信號通路對DNMT3B基因表達影響及調控尚未見報道。
　　在本文第一部分實驗中，我們在6株人肝癌(Human h

4、epatocellular carcinoma，HCC)細胞株中發(fā)現(xiàn)DNMT3B mRNA表達水平與Akt1 mRNA或Akt2 mRNA表達水平相關；不同HCC細胞株的DNMT3B3mRNA水平與DNMT3B4 mRNA水平比值有較大的差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)人肝癌組織中DNMT3B基因表達明顯高于其相對應癌旁組織。
　　為了探討Akt是否參與DNMT3B基因調控，在第二部分實驗中，我們首先檢測Akt作為上游調節(jié)劑及增量調節(jié)劑的PI

5、3K對DNMT3B基因影響，研究發(fā)現(xiàn)PI3K的小分子特異性抑制劑LY294002在BEL-7404細胞株中下調DNMT3BmRNA和蛋白質水平且呈劑量效應關系和時間效應關系。我們觀察到LY294002對DNMT3BmRNA表達的下調降低程度在各個時間點均高于其對DNMT3B蛋白的下調程度，提示LY294002對DNMT3B基因下調可能存在著轉錄水平調控。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)LY294002誘導DNMT3B基因表達下調并不伴隨DNMT3B亞

6、細胞定位變化。在SMCC7721細胞株及L02細胞株均觀察到LY294002降低DNMT3B基因表達。接著我們還應用蛋白質合成抑制劑CHX來檢測LY294002對DNMT3B基因表達下調是否與蛋白質從頭機器抑制相關，結果發(fā)現(xiàn)LY294002不影響DNMT3B蛋白的穩(wěn)定性。在第二部分實驗中，我們還利用本實驗室已經建立的持續(xù)性活化Akt2的小鼠胚胎成纖維細胞株(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)及穩(wěn)定轉染Ak

7、t1/2shRNA的BEL-7404細胞株去研究Akt對DNMT3B基因調控作用，發(fā)現(xiàn)Akt2持續(xù)性活化導致DNMT3BmRNA及蛋白質水平升高，而在BEL-7404細胞中敲低Akt1/2引起DNMT3BmRNA及蛋白質水平均降低。再者，我們觀察到Akt下游信息分子糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑氯化鋰可促進DNMT3B基因表達中度增加。以上實驗結果表明DNMT3B基因表達

8、受到PI3K/Akt信號通路的調控。
　　為了深入闡明PI3K/Akt信號通路調控DNMT3B基因表達的分子機制，在第三部分實驗中，我們研究了LY294002對DNMT3B啟動子活性的影響。首先我們依據Yanagisawa報道，構建了四個不同長度DNMT3B啟動子片段，包括核心啟動子序列及基本啟動子序列，并將它們克隆到pGL3-Basic熒光素酶報告基因上游，經測序比對正確后，選擇構建成功載體進行下一步試驗。我們通過瞬時轉染方法及

9、雙熒光素酶檢測系統(tǒng)研究啟動子質粒在BEL-7404細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)核心啟動子序列表達熒光素酶活性最高，結果與文獻報道中基本相同。接著我們觀察了LY294002對這四種DNMT3B啟動子活性影響，發(fā)現(xiàn)熒火蟲熒光素酶及作為內參的海腎熒光素酶活性均比LY294002未處理組低，因此，我們采用LY294002處理pGL3-Basic質粒(具有基本轉錄活性)前后相對熒光素酶活性比值作為判斷標準，若低于此標準被認為啟動子活性受到抑制。結果表明

10、，LY294002抑制DNMT3B啟動子活性。因此我們認為PI3K/Akt信號通路在轉錄水平調控了DNMT3B基因表達。在此部分中，我們還通過對DNMT3B的mRNA穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，LY294002可以促進DNMT3B mRNA降解，降低DNMT3B mRNA半衰期，表明LY294002對DNMT3B基因下調也存在轉錄后水平調控。實驗中我們觀察到HuR變化亦受LY294002調控，并呈現(xiàn)出時間效應關系，鑒于有研究報道HuR可增加DNMT

11、3B基因穩(wěn)定性，因此，我們推測HuR可能作為LY294002促進DNMT3B mRNA降解的中介物。此部分的實驗結果表明PI3K/Akt信號通路可在轉錄及轉錄后水平調控DNMT3B基因表達。
　　綜上所述，我們首次研究發(fā)現(xiàn)在人HCC細胞株BEL-7404中，PI3K/Akt信號通路可以下調DNMT3B基因表達，其下調機制是在轉錄水平和轉錄后水平；這一發(fā)現(xiàn)對我們認識PI3K/Akt信號通路和DNMT3B基因在肝癌發(fā)生機制中的作用具有