非標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建及其在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命的重要組成物質(zhì)之一，也是整個(gè)生命活動(dòng)的主要參與者。因此，蛋白質(zhì)的檢測(cè)特別是疾病狀態(tài)下蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)將有助于我們更深入的了解生命的活動(dòng)過(guò)程，對(duì)人類(lèi)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。生物傳感器是以生物分子作為識(shí)別元件(RecognitionElement)的檢測(cè)方法，因其具有高特異性、高靈敏度和操作便捷等特點(diǎn)成為目前最具有前景的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。抗體是目前應(yīng)用最為廣泛的生物分子識(shí)別元件，但是因其制備周期長(zhǎng)、易失活、對(duì)檢

2、測(cè)環(huán)境要求較高等缺點(diǎn)，限制了其在生物傳感器中的進(jìn)一步發(fā)展。近年來(lái)越來(lái)越多的新型識(shí)別元素正在被引入到生物傳感器的制備中，其中核酸適配體就是最為引人矚目的一員。適配體是利用SELEX體外篩選技術(shù)從龐大的核酸分子文庫(kù)中篩選獲得的單鏈DNA或RNA，它們除了具有類(lèi)似抗體的高親和性結(jié)合與高特異性識(shí)別特性外，還表現(xiàn)出許多優(yōu)于抗體的特性如分子量小、靶分子廣泛、易于重復(fù)合成、易于標(biāo)記、保存穩(wěn)定且可以變性復(fù)性等，因此適配體正逐漸成為是一種新的理想的生物傳

3、感器識(shí)別元件。電化學(xué)生物傳感器是一類(lèi)通過(guò)生物分子識(shí)別元件將待測(cè)物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)的電信號(hào)的檢測(cè)傳感器，其具有高靈敏度、不受溶液顏色影響，響應(yīng)速度快、操作便捷、價(jià)格低廉、易于微型化等優(yōu)點(diǎn)，將其與核酸適配體相結(jié)合，將成為繼免疫電化學(xué)傳感器和DNA電化學(xué)傳感器后新的研究熱點(diǎn)。
　　本課題的研究目的是建立一種高靈敏度、高特異性、操作便捷的蛋白質(zhì)電化學(xué)適配體生物傳感器。方式是將體外篩選得到的高特異性核酸適配體作為電化學(xué)生物傳感器的分子識(shí)

4、別元件，通過(guò)基于酶信號(hào)放大的設(shè)計(jì)策略，建立能夠非標(biāo)記地檢測(cè)蛋白質(zhì)的具有高靈敏度、高特異性的新型電化學(xué)適配體傳感器，并將其應(yīng)用于血小板生長(zhǎng)因子及蛇毒種類(lèi)鑒別檢測(cè)的研究中。論文內(nèi)容包括以下幾部分:
　　第一章引言簡(jiǎn)要的介紹了核酸適配體的篩選原理、優(yōu)越性及利用核酸適配體作為識(shí)別元件的方法學(xué)研究進(jìn)展;詳細(xì)的介紹了電化學(xué)傳感器的原理及應(yīng)用，以及基于酶信號(hào)放大的電化學(xué)適配體傳感器的研究進(jìn)展;著重論述了非標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器的設(shè)計(jì)策略和研究進(jìn)

5、展，并同時(shí)介紹了蛋白質(zhì)檢測(cè)的意義及方法學(xué)現(xiàn)狀。
　　第二章基于酶放大設(shè)計(jì)策略的非標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建近年來(lái)，許多氧化還原酶類(lèi)的直接電子傳遞(DET)得到了較多的重視和應(yīng)用。然而，由于固載基質(zhì)的不穩(wěn)定以及酶活性中心深埋在分子內(nèi)，如果將酶分子直接固定到固體電極上，其DET是很難實(shí)現(xiàn)的。為了克服這一缺陷，有不少工作提出將酶固定于納米材料修飾的電極表面，通過(guò)納米材料的優(yōu)點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的DET。其中，石墨烯(Gra)作為一種理想的材料，

6、由于其優(yōu)異的物理化學(xué)性能，如大的比表面積、好的導(dǎo)電性和易于功能化等，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。另一方面，納米金(GNPs)具有良好的生物相容性、強(qiáng)吸附能力和好的導(dǎo)電性，也被看作一種優(yōu)良的納米材料。這些性能也就使得PDDA保護(hù)的石墨烯-納米金(P-Gra-GNPs)復(fù)合物成為更優(yōu)異的固載基質(zhì)，它不僅能加快活性中心與電極之間的DET，更為酶的固定提供了一個(gè)良好的微環(huán)境。由此本研究在二甲基二烯丙基氯化銨均聚物(PDDA)存在下，采用肼將氧化石墨烯還

7、原，得到PDDA保護(hù)的還原石墨烯(P-Gra)。P-Gra表面帶正電，通過(guò)靜電吸附大量的納米金(AuNPs)，制得納米金功能化的石墨烯復(fù)合物(P-Gra-AuNPs)。利用酶的催化特性來(lái)放大識(shí)別過(guò)程中產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)。基于此，我們利用葡萄糖氧化酶(GOD)的直接電子傳遞(DET)首次構(gòu)建了一種新型無(wú)試劑無(wú)媒介的電化學(xué)適體傳感器，并用于對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)的檢測(cè)。
　　第三章基于電化學(xué)適配體傳感器的血小板源性生長(zhǎng)因子的檢

8、測(cè)血小板源性生長(zhǎng)因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)是一種低分子量促細(xì)胞分裂的肽類(lèi)調(diào)節(jié)因子，因正常生理狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒內(nèi)而得名，當(dāng)血液凝固時(shí)由破裂的血小板釋放出來(lái)并且被激活，具有刺激停滯于G0/G1期的成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等進(jìn)入分裂增殖周期的功能。血小板源性生長(zhǎng)因子的檢測(cè)在纖維化及癌癥等疾病的診斷、預(yù)后評(píng)估中具有重要的臨床意義。
　　我們利用血小板源性生長(zhǎng)因子適配體構(gòu)建

9、了基于酶放大的電化學(xué)核酸適配體傳感器，經(jīng)過(guò)對(duì)電化學(xué)傳感器修飾電極的表征，可以看到傳感器的氧化還原峰電流減小值與待測(cè)PDGF濃度成正比。該適體傳感器顯示出良好的電化學(xué)響應(yīng)，峰電流的減小值與濃度對(duì)數(shù)的增加值在0.005-60nM的范圍內(nèi)呈良好的線性，檢測(cè)限為1.7pM。該傳感器同樣具有高的選擇性，好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，也為其他基于適配體的蛋白檢測(cè)提供了可行的依據(jù)。
　　第四章蛇毒種屬特異性核酸適配體的篩選蛇傷的鑒別診斷需要準(zhǔn)確的檢測(cè)蛇毒

10、的類(lèi)型，目前蛇傷的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴以蛇毒抗體的免疫學(xué)診斷方法，但是蛇毒抗體目前存在特異性差、毒性強(qiáng)依靠免疫動(dòng)物制備困難等缺陷。受核酸適配體篩選原理(SELEX)中反篩原理的啟發(fā)，我們通過(guò)在適配體經(jīng)典篩選流程中引入多個(gè)鑒別靶標(biāo)的反篩流程，來(lái)獲取與目標(biāo)靶標(biāo)更高特異性結(jié)合的種屬特異性適配體，我們將該技術(shù)稱之為消減指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Depletesystematicevolutionofligandsbyexponentialenri

11、chment，Deplete-SELEX)。我們?cè)谏叨痉N屬特異性適配體篩選中引入了該方法，利用該技術(shù)篩選出用于鑒別中華眼鏡蛇毒與國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的三種種毒蛇（尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇、烙鐵頭）的中華眼鏡蛇毒種屬特異性核酸適配體，以利用于后續(xù)建立基于電化學(xué)適配體生物傳感器的蛇傷現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的研究。
　　第五章基于電化學(xué)適配體傳感器的蛇毒快速檢測(cè)方法的研究目前蛇傷的診斷主要依靠臨床癥狀（如傷口、局部體征等）、常規(guī)化驗(yàn)（血紅蛋白、尿膽紅素等）或捕

12、獲的蛇來(lái)確診，但由于蛇傷早期臨床癥狀往往不明顯、不典型，且大多數(shù)的蛇傷發(fā)生在晚間或山林草地中很難看清蛇種，導(dǎo)致野外條件下蛇傷不能得到及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，無(wú)法正確指導(dǎo)抗蛇毒血清的使用以至延誤搶救治療良機(jī)。多年來(lái)，也有研究者應(yīng)用免疫電泳、酶聯(lián)免疫以及放射免疫等方法檢測(cè)病人標(biāo)本中各種毒蛇的種屬特異性蛇毒成分，進(jìn)行蛇傷免疫學(xué)鑒別診斷方法的研究，但這些方法的敏感度不夠理想，陽(yáng)性檢出率受檢材的種類(lèi)、取材的時(shí)間、方法、診斷抗體的質(zhì)量等因素影響較大。電化學(xué)

13、適配體生物傳感器因其檢測(cè)速度快，靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)單便攜成為蛇毒診斷與現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的理想檢測(cè)手段。我們利用篩選得到的蛇毒種屬特異性核酸適配體與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合，構(gòu)建了用于檢測(cè)毒素的電化學(xué)適配體生物傳感器，結(jié)果顯示該傳感器在毒素種屬的鑒別檢測(cè)中具有很好的特異性與靈敏度，可能成為蛇傷檢測(cè)中的重要檢測(cè)手段。
　　綜上所述，我們采用GOD的直接電化學(xué)方法，成功構(gòu)建了一個(gè)基于核酸適配體的高靈敏和高選擇性的非標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器，

14、用于對(duì)血小板生長(zhǎng)因子及蛇毒特異性蛋白的檢測(cè)研究。該傳感器主要有以下優(yōu)點(diǎn):首先，P-Gra-GNPs復(fù)合物膜具有比表面積大和優(yōu)良的生物相容性，它不僅能增加GOD的固載量，還能保持生物分子的活性，提高傳感器的穩(wěn)定性。其次，GNCs膜為PBA的固定提供了一個(gè)穩(wěn)定和多孔的表面，進(jìn)一步增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。另外，雙層GOD膜作為示蹤劑帶來(lái)更高的電流響應(yīng)和高的靈敏度?；谝陨系脑?，該傳感器顯示出較低的檢測(cè)限，滿意的選擇性，良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。并且該方