水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY13的功能鑒定和調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、在植物的抗病反應(yīng)中，信號分子水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)著兩個截然不同的抗病信號途徑，而且通常認(rèn)為這兩個途徑存在一定程度的拮抗。大量的研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族在上述植物抗病反應(yīng)中扮演著重要的角色。白葉枯病和稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的兩個重要病害，盡管目前在水稻基因組中已經(jīng)鑒定了109-112個WRKY基因，但是關(guān)于此家族成員在水稻抗病反應(yīng)中的作用仍然不是很清楚，特別是關(guān)于WRKY因子在抗病信號傳導(dǎo)途徑中的地位。本研究

2、通過運(yùn)用各種功能基因組學(xué)的研究手段，研究了一個受病原誘導(dǎo)的水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY13在水稻抗病反應(yīng)中的主要功能。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在感病品種牡丹江8中超量表達(dá)OsWRK13，共分離檢測結(jié)果表明，無論是苗期還是成株期都增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯病和稻瘟病的抗性；相反的是，反義抑制的明恢63轉(zhuǎn)化植株也表現(xiàn)了對白葉枯病感病性的提高。采用定量RT-PCR的方法進(jìn)一步檢測了上述轉(zhuǎn)基因植株中病程相關(guān)蛋白和其它與水楊酸及茉莉酸

3、代謝相關(guān)的基因的表達(dá)情況。在接種前后的至少在一個檢測時間點(diǎn)OsWRK13超量表達(dá)植株中比對照牡丹江8聚集了更多的PRla基因的轉(zhuǎn)錄本，而且反義表達(dá)植株中互補(bǔ)了這種表達(dá)模式；同時，PR10和JIOsPR10基因的表達(dá)量在OsWRKY13超量表達(dá)植株中比對照牡丹江8的明顯要低；而對11個與水楊酸、茉莉酸或者環(huán)氧脂類信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示，OsWRKY13的表達(dá)量提高至少在一個時間點(diǎn)顯著地誘導(dǎo)了基因CHS，PAD4和ICS1的表達(dá)

4、，但是部分抑制基因OsWRKY13的表達(dá)量對這3個基因的表達(dá)沒有影響；同時，超量表達(dá)OsWRK13則顯著抑制了基因AOS2和POX的表達(dá)，而且抑制OsWRKY13顯著提高了這兩個基因的表達(dá)。利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明了OsWRKY13對PRla，AOSl，AOS2和LOX的啟動子具有很強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活能力，而對ICSl，NH.，和PAD4則沒有；同時利用超量表達(dá)植株的核蛋白和重組蛋白OsWRKY13-GST進(jìn)行的體外DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)磷酸化實(shí)驗(yàn)進(jìn)

5、一步表明，OsWRKY13能特異的結(jié)合到W-盒或者類W-盒上，而且這種結(jié)合受到病原物侵染的調(diào)控影響，推測這種影響部分來自對蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生的改變。結(jié)合超量表達(dá)植株中水楊酸含量提高和茉莉酸含量下降的結(jié)果，我們認(rèn)為OsWRKY13通過激活水楊酸信號途徑和抑制茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑，參與水稻的抗病反應(yīng)。 為了進(jìn)一步分析OsWRKY13所調(diào)控的下游基因以及其調(diào)控方式，本研究對超量表達(dá)植株芯片分析中所獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行了深入的分析。首

6、先，差異表達(dá)基因的Geneontology(GO)分類顯示OsWRKY13正調(diào)控類黃酮代謝，負(fù)調(diào)控萜類和脂類代謝過程，而上述過程正好分別與水楊酸和茉莉酸的代謝途徑相關(guān)；其次，進(jìn)一步統(tǒng)計分析了差異表達(dá)基因啟動子區(qū)保守順式元件，并通過采用窮舉法的方法掃描了差異表達(dá)基因啟動子區(qū)域的保守模體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上升表達(dá)的基因中顯著富集了W-盒(GTTGACC)，而在下降的基因中富集了MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，同時GCC-盒在下降基因的啟動子區(qū)域中呈明顯

7、的減少趨勢，并且這種順式調(diào)控元件的變化正好與差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相吻合。因此，推測OsWRKY13很可能協(xié)同MYB和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因，影響類黃酮代謝和脂類代謝過程。此外，本研究還分析了OsWRKY13與其它水稻W(wǎng)RKY家族成員的關(guān)系以及與擬南芥AtWRKY70共調(diào)控的基因。結(jié)果表明，OsWRKY13超量表達(dá)后負(fù)調(diào)控許多水稻W(wǎng)RKY基因，特別是與ABA信號相關(guān)的；同時在擬南芥AtWRKY70與OsWRKY13參與的抗病反應(yīng)