慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響.pdf

1、背景:阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征在兒童較常見，嚴重影響兒童多器官功能，尤以神經(jīng)系統(tǒng)為著，主要表現(xiàn)為認知功能障礙。有研究認為神經(jīng)元細胞凋亡是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)引起認知功能障礙的重要因素之一，而目前OSAHS引起神經(jīng)系統(tǒng)病理生理變化機制未完全闡明。
　　 目的:本研究通過觀察慢性間歇性低氧對腦區(qū)腺苷酸活化蛋白激酶(The5-AMP-

2、activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(MammalianTarget of Rapamycin，mTOR)通路的影響，進而明確這條通路與慢性間歇性低氧誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡的關(guān)系。從而為兒童OSAHS導(dǎo)致認知功能障礙的病理生理研究及治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法:將SD幼鼠隨機分為4組，分別為2周慢性間歇低氧組(2IH)和4周慢性間歇低氧組(4IH)、2周空氣模擬對照組(2A

3、C)和4周空氣模擬對照組(4AC)，每組均8只。將慢性間歇性低氧組幼鼠放入低氧艙內(nèi)，設(shè)置電腦參數(shù)90s為一次循環(huán)，使艙內(nèi)最低氧濃度波動在(10.0±1.5)％，復(fù)氧時最高氧濃度波動在(21.0±0.5)％，監(jiān)測CO2濃度，使其維持在小于0.01％，控制艙內(nèi)溫度22～24℃，濕度40～50％。將空氣模擬對照組幼鼠放入空氣模擬對照艙中，控制溫度、濕度、CO2濃度與慢性間歇性低氧艙一致，艙內(nèi)泵入壓縮空氣。所有艙體外側(cè)用黑色布遮蓋模擬黑夜，每天

4、在艙內(nèi)時間為7.5個小時，出艙后采用日光燈照射模擬白天。另取SD幼鼠予頸動脈留置針，每組5只，分別放入慢性間歇性低氧氧艙及對照艙內(nèi)，在造模期間抽取動脈血并行動脈血氣分析，根據(jù)血氣分析結(jié)果判斷模型是否成功。造模結(jié)束后取每組2只幼鼠，用多聚甲醛灌注后取腦，在視交叉后1mm及4mm處冠狀切面切開，取中間腦塊及前額皮層，包埋切片后行TUNEL法檢測凋亡。取幼鼠左、右海馬區(qū)及前額皮層區(qū)組織，用熒光實時定量PCR法測海馬、皮層AMPK、結(jié)節(jié)性硬化復(fù)

5、合物1(tuberous sclerosis complex-1，TSC1)、結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2（tuberous sclerosis complex-2，TSC2）、mTOR mRNA表達，用western blot法檢測海馬、皮層通路上下游關(guān)鍵蛋白:磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.模型驗證:動脈血氣分析結(jié)果:模型組幼鼠動脈血最低氧分

6、壓(PO2)為(43±4) mmHg，最低氧飽和度(SaO2)為(76±3)％，血氧飽和度波動明顯。對照組幼鼠動脈血氣PO2為(96±1)mmHg，SaO2為(97±4)％，血氧飽和度差異不明顯。
　　 2.海馬、前額皮層區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)結(jié)果:與2AC組比，2IH組海馬、前額皮層區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與4AC組比，4IH組海馬、前額皮層區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);

7、與2IH組比，4IH組海馬、前額皮層區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);2AC、4AC組比較海馬、前額皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.實時熒光定量PCR法檢測:(1)與2AC組比，2IH組海馬、前額皮層區(qū)TSC1、TSC2、AMPK mRNA表達升高，mTOR表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與4AC組比，4IH組海馬、前額皮層區(qū)TSC1、TSC2、AMPK mR

8、AN表達升高，mTOR表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與2IH組比，4IH組海馬、前額皮層區(qū)TSC1、TSC2、AMPK mRNA表達升高，mTOR表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;2AC組、4AC組兩組比較，海馬、前額皮層區(qū)TSC1、TSC2、AMPK、mTOR mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.Western blot檢測海馬、前額皮層區(qū)關(guān)鍵蛋白p-AMPK和p-mTOR含量:(1) p-AMP

9、K表達:與2AC組比，2IH組海馬、前額皮層區(qū)p-AMPK蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與4AC組比較，4IH組海馬、前額皮層區(qū)p-AMPK蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與2IH組比較，4IH組海馬、前額皮層區(qū)p-AMPK蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。(2) p-mTOR表達:與2AC組比較，2IH組海馬、前額皮層區(qū)p-mTOR蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與4AC

10、組比較，4IH組海馬、前額皮層區(qū)p-mTOR蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與2IH組比，4IH組海馬、前額皮層區(qū)p-mTOR蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.慢性間歇性低氧導(dǎo)致幼鼠海馬、前額皮層區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡，且與慢性間歇性低氧時間相關(guān)。
　　 2.慢性間歇性低氧后，激活海馬、前額皮層區(qū)AMPK，進而活化TSC1、TSC2，從而抑制mTOR活性，誘導(dǎo)細胞凋亡。