小檗堿和甲基蓮心堿對人成骨肉瘤細胞的生長抑制作用及其機制研究.pdf

1、成骨肉瘤是惡性骨腫瘤中最常見的一種，發(fā)病年齡多在10-25歲，嚴重威脅兒童和青少年的健康。成骨肉瘤對放射治療不敏感，主要采取手術聯合化療的手段進行治療，但是目前使用的腫瘤化療藥物存在副作用大和腫瘤細胞易產生耐藥性等缺陷，因而從天然化合物中尋找低毒、高效的抗癌藥物對于成骨肉瘤的治療有重要意義。 為深入研究小檗堿及甲基蓮心堿的抗腫瘤作用及其分子機制，本課題進行了以下四個方面的工作： 第一部分小檗堿和甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞和正

2、常成骨細胞生長的抑制作用 為了檢測小檗堿及甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞和正常成骨細胞的抑制作用，我們選用了人成骨肉瘤細胞U20S、Saos-2、HOS和正常成骨細胞HCO進行實驗。通過形態(tài)學觀察、四唑鹽比色法、BrdU摻入法分析小檗堿及甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞及正常成骨細胞的抑制作用。 1、形態(tài)學觀察和MTT法檢測發(fā)現： （1）小檗堿及甲基蓮心堿對人成骨肉瘤細胞U20S具有明顯的抑制作用并呈劑量依賴性和時間依賴性。

3、 （2）對比分析小檗堿和甲基蓮心堿對U20S的抑制作用發(fā)現，甲基蓮心堿具有更顯著的抑制作用，如藥物處理24h后分析，4μmol/L甲基蓮心堿處理的細胞存活率為50.6％，而135μmol/L小檗堿處理的細胞存活率為75.7％。 2、采用BrdU摻入法檢測小檗堿處理后U20S細胞的增殖情況發(fā)現，U20S細胞中處于增殖期的細胞數目隨藥物濃度的升高而逐漸減少，與對照細胞相比有顯著差異。該結果進一步證實了小檗堿對U20S細胞的抑制

4、作用。 3、MTT法檢測小檗堿及甲基蓮心堿對人成骨肉瘤細胞Saos-2、HOS和正常成骨細胞HCO生長的抑制作用時發(fā)現： （1）小檗堿及甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞均有抑制作用并呈明顯的劑量依賴性和時間依賴性。 （2）小檗堿及甲基蓮心堿對正常成骨細胞HCO的毒性明顯低于腫瘤細胞，低濃度的甲基蓮心堿對正常成骨細胞不僅沒有抑制作用，而且能促進正常成骨細胞的存活。 以上結果表明小檗堿及甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞的生長

5、具有明顯的抑制作用：而且對多種成骨肉瘤細胞均有抑制作用，具有普遍性；更重要的是兩種生物堿對腫瘤細胞具有較好的殺傷作用，而對正常細胞毒性較小。因此深入研究兩種藥物的抗腫瘤機制具有重要意義。 第二部分小檗堿和甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞和正常成骨細胞細胞周期的影響及其作用機制 導致細胞周期停滯是抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞生長的重要機制之一。因此，我們采用流式細胞儀、Real-time PCR及Western Blotting等方法研

6、究小檗堿和甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞細胞周期的影響及其作用機制。 1、PI染色流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現： （1）U2OS和正常成骨細胞HCO經小檗堿處理后G1期細胞隨藥物濃度升高而逐漸增多，S期細胞隨藥物濃度升高而逐漸減少，小檗堿使U2OS和HCO細胞停滯于G1期，研究結果還顯示50μg/ml的小檗堿使U2OS細胞出現G2/M期的累積；Saos-2細胞經小檗堿處理后G1期和S期細胞沒有規(guī)律性變化，G2/M期細胞隨藥物濃度

7、升高而逐漸增多，小檗堿使Saos-2停滯于G2/M期。 （2）U2OS和Saos-2細胞經甲基蓮心堿處理后G1期細胞隨藥物濃度升高而逐漸增多，S期細胞隨藥物濃度升高而逐漸減少，甲基蓮心堿處理后使U2OS和Saos-2細胞停滯于G1期。 2、Western Blotting和Real-time PCR方法檢測兩種藥物處理后p53基因及與G1期停滯相關蛋白的變化發(fā)現： （1）小檗堿處理下調U2OS細胞cyclin D

8、1、cyclin E的表達，而上調p53、p21和p27的表達；小檗堿可以從mRNA和蛋白質兩個水平來激活p53。 （2）甲基蓮心堿引起U2OS細胞G1期停滯是通過上調p21的表達而下調Cyclin E的表達實現的，cyclin D1和p53的表達沒有規(guī)律性改變。 3、降低U2OS細胞p53蛋白活性對小檗堿引起U2OS細胞G1期停滯的影響 穩(wěn)定轉染p53突變載體降低U2OS細胞內源性p53蛋白的活性，并用流式細胞

9、儀檢測細胞周期變化發(fā)現：轉染空載體的細胞隨藥物濃度升高G1期細胞逐漸增多，S期細胞逐漸減少；轉染mtp53載體的細胞，G1期細胞逐漸增多、S期細胞逐漸減少的趨勢被明顯削弱。 以上結果顯示，小檗堿誘導U2OS細胞G1期停滯并下調cyclin D1、cyclin E的表達，而上調p53、p21和p27的表達；小檗堿可以從mRNA和蛋白質兩個水平來激活p53。p53參與了小檗堿引起的成骨肉瘤細胞的G1期停滯，G2/M期的停滯與p53無

10、關。甲基蓮心堿引起成骨肉瘤細胞G1期停滯是通過上調p21的表達而下調CyclinE的表達來實現的，與p53無關。 第三部分小檗堿和甲基蓮心堿對成骨肉瘤細胞凋亡的影響 化療藥物抗腫瘤的另一重要機制是誘導腫瘤細胞凋亡。因此，本部分采用AnnexinⅤ-PI雙染法、TUNEL法檢測了小檗堿及甲基蓮心堿處理后成骨肉瘤細胞的凋亡情況；并用Real-time PCR法檢測了U2OS-neo和U2OS-mtp53細胞經小檗堿處理后p5

11、3下游與凋亡相關基因的表達情況。 1、形態(tài)學觀察及TUNEL法檢測小檗堿對成骨肉瘤細胞及正常成骨細胞凋亡的影響。結果顯示小檗堿能夠誘導成骨肉瘤細胞和正常成骨細胞發(fā)生凋亡；凋亡率隨小檗堿濃度的升高而增加；相同濃度的小檗堿處理后正常細胞的凋亡率低于腫瘤細胞，p53缺陷細胞Saos-2在低濃度時凋亡率與正常細胞沒有顯著差異。 2、TUNEL法檢測小檗堿處理U2OS-mtp53和U2OS-neo細胞的凋亡。小檗堿可以誘導U2OS

12、-mtp53細胞及U2OS-neo細胞凋亡，U2OS-mtp53細胞的凋亡率明顯低于同樣濃度小檗堿處理的U2OS-neo細胞。該結果初步說明p53參與小檗堿引起的U2OS細胞凋亡。 3、Real-time PCR檢測p53下游凋亡相關基因的表達。為了進一步證明p53參與了小檗堿引起的U2OS細胞凋亡，我們用小檗堿處理U2OS-mtp53和U2OS-neo細胞，檢測p53下游與凋亡相關基因mRNA的表達水平。U2OS-neo細胞經

13、小檗堿處理后，p53下游與凋亡相關的基因BAX、PUMA和FAS的mRNA表達顯著上升，并呈劑量依賴性；U2OS-mtp53細胞經小檗堿處理后，BAX、PUMA和FAS的mRNA表達水平沒有明顯變化。該結果進一步證明p53參與小檗堿引起的U2OS細胞凋亡。 4、AnnexinⅤ-PI雙染法檢測甲基蓮心堿對U2OS細胞凋亡的影響。結果顯示甲基蓮心堿處理后細胞的凋亡率與對照組細胞相比沒有明顯差別，說明甲基蓮心堿對U2OS細胞凋亡沒有

14、明顯誘導作用。 以上結果表明小檗堿誘導成骨肉瘤細胞和正常成骨細胞凋亡，相同濃度的小檗堿引起正常細胞凋亡率低于腫瘤細胞。p53通過激活下游與凋亡相關基因BAX、PUMA和FAS的表達而參與小檗堿誘導的U2OS細胞凋亡。誘導凋亡不是甲基蓮心堿抑制成骨肉瘤細胞生長的機制。 第四部分初步探討小檗堿引起腫瘤細胞周期停滯和細胞凋亡的上游因素 前期實驗結果證實，p53在小檗堿抑制成骨肉瘤細胞生長過程中發(fā)揮了重要作用，參與了小檗

15、堿引起的細胞周期停滯和細胞凋亡。小檗堿升高p53的磷酸化水平并上調p53 mRNA表達水平。那么p53又是怎樣被激活的？我們推測DNA損傷可能是小檗堿激活p53并引起細胞周期停滯和細胞凋亡的上游因素。本部分采用免疫熒光結合Western Blotting方法檢測小檗堿處理U2OS細胞后γ-H2AX的累積：并用微核率檢測U2OS細胞基因組的不穩(wěn)定性。結果如下： 1、免疫熒光和Western Blotting檢測小檗堿處理U2OS細

16、胞后γ-H2AX的累積。免疫熒光結果顯示小檗堿可以導致γ-H2AX在細胞內累積，隨藥物濃度的升高γ-H2AX陽性細胞增多，焦點更多更亮。Western Blotting結果顯示，隨小檗堿濃度的升高，磷酸化H2AX的表達水平逐漸增強。 2、相同濃度的小檗堿引起正常成骨細胞HCO中γ-H2AX累積要低于U2OS細胞。相同濃度的小檗堿處理后在U2OS細胞中的熒光累積要比HCO細胞強，說明與HCO細胞相比小檗堿更容易進入U2OS細胞。

17、 3、微核計數發(fā)現，小檗堿處理后隨藥物濃度的升高，U2OS細胞微核率與對照細胞相比有顯著上升趨勢。 4、免疫熒光檢測甲基蓮心堿處理U2OS細胞γ-H2AX的累積。甲基蓮心堿處理U2OS細胞未發(fā)現典型的γ-H2AX焦點出現，說明甲基蓮心堿不能導致γ-H2AX在細胞內的累積。 以上結果表明，小檗堿處理U2OS細胞引起γ-H2AX的累積和微核率的上升，說明導致DNA損傷是小檗堿激活成骨肉細胞p53并引起細胞周期停滯和細胞