縫隙連接蛋白43參與腦血管痙攣的體外實驗研究.pdf

1、目的:
　　縫隙連接(gap junction,GJ)是相鄰細胞間最直接快速的通訊方式,對維持血管細胞間的協(xié)同反應起重要作用。在血管系統(tǒng)中共發(fā)現(xiàn)4種縫隙連接蛋白(connexion,Cx),包括Cx37、Cx40、Cx43和Cx45,其中Cx43最為重要, Cx43表達的紊亂,將會導致一系列的病理反應及疾病。前期研究表明Cx43及其相關縫隙連接通道與腦血管痙攣(Cerebral vasospasm,CVS)關系密切,但機制尚不清楚

2、。本課題在前期研究的基礎上,對Cx43參與CVS的機制進行深入研究,以期通過體外細胞實驗初步探明Cx43參與CVS的相關分子機制。
　　材料與方法:
　　1.原代大鼠基底動脈平滑肌細胞(SMCs)的培養(yǎng)和鑒定:分離SD-大鼠基底動脈,利用組織貼塊法進行平滑肌細胞原代培養(yǎng),采用細胞免疫熒光技術對其進行鑒定。
　　2.shRNA-Cx43腺病毒載體的構建及感染效率的檢測:構建質(zhì)粒,利用293A細胞進行包裝和滴度檢測;用不同

3、稀釋度的病毒對平滑肌細胞進行感染,綜合細胞生長狀態(tài)以及熒光表達量來判斷具有最佳作用效果的病毒稀釋度,并以此稀釋度作為后續(xù)試驗的依據(jù)。同時,采用Western blot檢測病毒感染平滑肌細胞后Cx43表達水平的變化。
　　3.腦血管痙攣體外細胞模型的構建及腦血管痙攣后細胞間收縮信號交流的改變:利用OxyHb刺激平滑肌細胞構建腦血管痙攣雙層共培養(yǎng)模型,在此基礎上采用Wester blot技術檢測平滑肌細胞Cx43表達的變化,采用HE染

4、色觀察平滑肌細胞長度的變化,并用共聚焦顯微鏡觀察并檢測Calcein AM、Ca2+、IP3在SMC與SMC、SMC與EC間縫隙連接的交流情況。
　　4.Cx43表達量的降低對腦血管痙攣體外模型信號通訊的影響:利用shRNA-Cx43腺病毒感染平滑肌細胞,采用同樣方法構建腦血管痙攣雙層共培養(yǎng)模型,在此基礎上采用Wester blot技術檢測平滑肌細胞Cx43表達的變化,采用HE染色觀察平滑肌細胞長度的變化,并用共聚焦顯微鏡觀察并檢

5、測Calcein AM、Ca2+、IP3在SMC與SMC、SMC與EC間縫隙連接的交流情況。
　　結果:
　　1.成功培養(yǎng)出原代基底動脈平滑肌細胞,經(jīng)光鏡觀察及細胞免疫熒光鑒定,平滑肌細胞形態(tài)正確,生長狀態(tài)良好,純度較高;
　　2.成功構建PAV.KdSi.U/eGFP-U6-shCx43質(zhì)粒,病毒包裝7d后可見病毒病變斑(CPE)形成,病毒原液(P0)滴度為1.07×1011 PFU/mL,當MOI值取100時,感染

6、效率最高。經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Cx43在24h表達水平最低,之后基本保持穩(wěn)定,感染達到預期效果。
　　3.通過檢測正常平滑肌細胞、OxyHb刺激24h、OxyHb刺激48h、OxyHb刺激72h時Cx43表達情況及平滑肌細胞長度,發(fā)現(xiàn)OxyHb刺激后Cx43表達量逐漸增加,在48h時到達高峰,之后又逐漸下降。平滑肌細胞長度變化情況與Cx43表達相符,在OxyHb刺激后平滑肌細胞長度縮短,在48h時到達高峰,之后又逐漸

7、增加。當使用腺病毒感染降低平滑肌Cx43的表達后,OxyHb刺激后平滑肌細胞收縮強度有所緩解,長度較未感染前增加。
　　4.通過激光共聚焦顯微鏡觀察分析雙層細胞共培養(yǎng)模型上“受體細胞”的熒光強度,發(fā)現(xiàn)shRNA-Cx43腺病毒感染平滑肌后,能夠減弱染料Calcein AM和Ca2+在平滑肌細胞間的傳輸,同時也可以減弱IP3從平滑肌細胞向內(nèi)皮細胞的傳輸。各組“對照細胞”均無熒光出現(xiàn),說明各信號分子由縫隙連接在細胞間傳輸。
　　

8、結論:
　　1.SMCs上Cx43表達隨著OxyHb刺激時間的延長逐漸升高,同時SMCs長度逐漸變短,在48h到達高峰,之后逐漸恢復;降低SMCs上Cx43的表達后能有效的緩解平滑肌細胞收縮;Cx43表達量的改變與SMCs收縮有關。
　　2.Cx43表達量的改變能夠影響非特異性物質(zhì)Calcein AM和收縮因子Ca2+在平滑肌細胞間的交流,同時也會影響IP3在SMCs與VECs間的傳輸,Cx43表達量越高,縫隙連接對這些物質(zhì)