自由基清除劑依達拉奉對脊神經(jīng)結扎大鼠痛行為的影響及其機制研究.pdf

1、[目的]神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)疾病或其它疾患所導致的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙既而引起的疼痛。然而由于神經(jīng)源性疼痛的發(fā)病機制尚不完全清楚,到目前為止,臨床上仍缺乏滿意地鎮(zhèn)痛藥物。對于慢性神經(jīng)病理性疼痛的治療,目前除了非甾體抗炎藥和阿片制劑以外,并沒有很多的選擇,其治療的滿意率小于≤30％。某些慢性病患者很容易對嗎啡形成依賴,甚至成癮,而非甾體抗炎藥又有很多的不良反應,因此需要介于這兩者之間的藥物。新近的研究發(fā)現(xiàn)活性氧參與了神經(jīng)痛和炎性痛的

2、發(fā)生和發(fā)展。依達拉奉是日本新開發(fā)的一種針對腦梗死急新型自由基清除劑,有學者將其用于炎癥痛的實驗研究,發(fā)現(xiàn)依達拉奉具有鎮(zhèn)痛作用,但是到目前為止,還未見其用于治療神經(jīng)病理性疼痛的研究。本實驗采用脊神經(jīng)結扎模型誘發(fā)經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型,觀察自由基清除劑依達拉奉是否具有鎮(zhèn)痛作用,如果證實其有鎮(zhèn)痛作用后,則進行初步的機制探討。 [方法]行為學實驗采用脊神經(jīng)結扎(SNL)神經(jīng)病理性疼痛模型,以機械刺激(Von Frey hair)為研究

3、方法,分別觀察依達拉奉預給藥和治療干預對神經(jīng)痛大鼠機械痛閾的影響。在觀察依達拉奉治療干預效果時,在脊神經(jīng)結扎后第三天神經(jīng)痛發(fā)生以后,分別給予疼痛大鼠2、4、8 mg/kg依達拉奉(2/d)和生理鹽水對照組,觀察依達拉奉的鎮(zhèn)痛效果；觀測依達拉奉預干預效果時,在手術前-天給予依達拉奉,然后持續(xù)2天給藥,分組及行為學檢測同治療干預。電生理學實驗采用H2O2誘發(fā)的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)氧化損傷模型作為研究工具。急性分離培養(yǎng)正常大鼠雙側腰5 DRG

4、,選中對辣椒素有反應的小細胞為研究對象,觀察依達拉奉預給藥和治療干預對200μmol/L H2O2誘發(fā)氧化損傷的細胞膜電位的影響。 分子生物學實驗研究分為假手術組、SNL組、依達拉奉干預組,以免疫組織化學和western blot技術為方法,觀察脊神經(jīng)結扎神經(jīng)痛模型中pJNK在DRG和脊髓中的表達分布及觀察依達拉奉對pJNK的表達的影響。 [結果] 行為學實驗: (1)依達拉奉治療干預實驗:①脊神經(jīng)結扎后

5、第三天大鼠痛閾達到最低,機械閾值(PWMT)為3.3±1.7g;痛敏持續(xù)到本實驗結束,第10天PWMT為3.1±1.8g；②2 mg/kg和4 mg/kg依達拉奉干預組大鼠痛閾的改變和生理鹽水對照組沒有統(tǒng)計學差異；③8mg/kg依達拉奉干預組產(chǎn)生微弱的鎮(zhèn)痛作用,鎮(zhèn)痛效果持續(xù)2天,在停止給藥3天后,大鼠痛行為和對照組沒有統(tǒng)計學差別。 (2)依達拉奉預處理實驗 4mg/kg依達拉奉預處理組術后5天PWMT和對照組有統(tǒng)計學差異干預組大

6、鼠痛閾的改變和生理鹽水對照組有統(tǒng)計學差異；在術后第六天,依達拉奉預處理組PWMT和生理鹽水對照組統(tǒng)計學差異不明顯。 電生理學實驗： (1)在H2O2誘導的細胞氧化損傷模型中,神經(jīng)元電壓閾值發(fā)生較持久的改變,膜電位由-58.13±2.41mv增高到-42.32±3.08mv,兩者之間有統(tǒng)計學差異,而后用依達拉奉干預后,并沒有改變H2O2誘發(fā)的神經(jīng)元電壓閾值； (2)首先給予依達拉奉預處理神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元膜電位開始

7、降低,發(fā)生超極化現(xiàn)象,當膜電位不再發(fā)生變化時,細胞外液給予400μM H2O2,依達拉奉可以明顯抑制H2O2誘導的去極化。 分子生物學實驗： (1)依達拉奉減少L5DRG中pJNK陽性神經(jīng)元的表達。假手術組、SNL組與依達拉奉預處理組大鼠分別于脊神經(jīng)結扎后24小時取材,觀察切片發(fā)現(xiàn)pJNK主要表達在小細胞神經(jīng)元,模型組pJNK陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯高于對照組,兩者存在明顯的統(tǒng)計學差異；依達拉奉干預組pJNK陽性神經(jīng)元數(shù)量為9

8、3±8,和SNL組陽性神經(jīng)元數(shù)量124±5也存在統(tǒng)計學差異；Western blot定量顯示JNK1(46 kDa)在SNL組DRG存在高表達,依達拉奉可以降低神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)中pJNK的含量。 (2)依達拉奉減少脊髓星型膠質細胞pJNK的表達。假手術組、SNL組與依達拉奉預處理組大鼠分別于脊神經(jīng)結扎3d后取材,觀察切片。免疫雙熒光顯示pJNK在脊髓中只在星型膠質細胞中表達,并且在脊神經(jīng)損傷后,GFAP/pJNK陽性細胞在損傷側