組蛋白H3K9甲基化調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞自我復(fù)制的研究.pdf

1、目的：腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小群具有自我復(fù)制和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，其自我復(fù)制受到轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、內(nèi)外環(huán)境等多種因素的復(fù)雜調(diào)控。組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）甲基化修飾是調(diào)控腫瘤干細(xì)胞自我復(fù)制的重要機(jī)制，在正常分化細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中起抑制基因表達(dá)的作用。H3K9甲基化對(duì)自我復(fù)制相關(guān)基因的抑制可能與腫瘤干細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的分化有關(guān)。因此我們推測(cè)，使用特異性的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑解除組蛋白甲基化對(duì)自我復(fù)制相關(guān)基因的抑制，就能促進(jìn)腫

2、瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞。也就是說(shuō)在體內(nèi)條件下，內(nèi)外環(huán)境的刺激如果降低了組蛋白甲基化的抑制，就有可能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生或腫瘤的復(fù)發(fā)，這可能是體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞發(fā)生的重要啟動(dòng)機(jī)制之一。本文針對(duì)這一假說(shuō)設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，探討H3K9甲基化對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我復(fù)制的影響；以及H3K9甲基化與干細(xì)胞的核心轉(zhuǎn)錄因子Sox2和腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志分子CD133之間的關(guān)系。
　　方法：本文使用了膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87；三種抑制劑：5-Azacyti

3、dine(5-aza), DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）抑制劑；Bix01294(Bix)，H3K9組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a抑制劑；Sodium butyrate(SB)，組蛋白去乙?；敢种苿┻M(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：（1）用體外克隆成球率實(shí)驗(yàn)研究對(duì)自我復(fù)制的影響；用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)研究對(duì)致瘤性的影響；用Real-TimePCR和Western blot等方法研究對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD133表達(dá)的影響；（2）在體外克隆成球培養(yǎng)條件下，使用上述抑制劑處理，

4、并用Real-TimePCR和Western blot等方法研究對(duì)Sox2/CD133/Oct4等干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響；（3）使用H3K9me2抗體做染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，使用CD133、Sox2等基因的啟動(dòng)子區(qū)的特異引物，用PCR法檢測(cè)這些基因是否受到H3K9me2的調(diào)控；（4）通過(guò)免疫組化的方法，比較研究臨床膠質(zhì)瘤病理標(biāo)本的H3K9me2和CD133等表達(dá)水平，驗(yàn)證H3K9甲基化抑制與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系。
　

5、　結(jié)果：（1）經(jīng)篩選研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a抑制劑Bix01294可以明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的克隆細(xì)胞球形成率、軟瓊脂克隆生長(zhǎng)率；而去乙?；敢种苿?、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用不明顯。（2）Real-TimePCR和Western blot發(fā)現(xiàn)H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Bix01294處理可以促進(jìn)CD133的表達(dá)；對(duì)Sox2/Oct4/c-myc等基因的PCR和Western blot研究表明，Bix01294處理可以促進(jìn)Sox2的

6、表達(dá)，對(duì)Oct4、c-myc則作用不明顯。（3） ChIP實(shí)驗(yàn)表明Sox2的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)和CD133的啟動(dòng)子p1區(qū)均受到H3K9me2的抑制，而Oct4啟動(dòng)子區(qū)不受H3K9me2的抑制。（4）我們對(duì)8例原發(fā)和復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤病人的病理組織進(jìn)行免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)一例CD133強(qiáng)陽(yáng)性的病人其H3K9me2染色為陰性，而其它病人為H3K9me2陽(yáng)性，其CD133表達(dá)多為陰性。對(duì)復(fù)發(fā)和原發(fā)病人的CD133和H3K9me2陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)沒(méi)有顯著性差異。<