氧化應激通過P38sapk途徑上調P16基因表達引起卵泡膜間質細胞的衰老.pdf

1、第一部分:小鼠卵巢卵泡膜間質細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定新方法
　　目的:建立一種簡單易行的分離未成年小鼠卵巢卵泡膜間質細胞的方法,并對分離細胞進行培養(yǎng)和功能鑒定。
　　方法:選取未成年C57BL/6小鼠(21-25d)的卵巢組織,在體式顯微鏡下分離干凈周圍組織并去包膜,用機械法去除顆粒細胞,將殘余組織在LSP培養(yǎng)基清洗兩次后用膠原酶Ⅳ-DNase(4g/L膠原酶,10g/L DNase和10g/L BSA溶于M199培養(yǎng)液)在3

2、7℃,5％CO2培養(yǎng)箱中消化分離卵泡膜間質細胞,用含10%胎牛血清及10ng/ml雄激素的McCoy’s 5a培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并用免疫細胞化學技術、蛋白印跡技術、激素檢測對培養(yǎng)的卵泡膜間質細胞進行鑒定。通過卵泡膜-間質細胞在不同濃度的FSH和LH條件下激素水平的改變,檢測該細胞激素分泌反應性。
　　結果:通過上述分離方法得到的細胞存活率在90%以上,細胞在培養(yǎng)24小時內貼壁生長,細胞貼壁生長成梭形和不規(guī)則三角形,且能在含10%胎牛

3、血清及10ng/ml雄激素McCoy’s 5a培養(yǎng)基中分裂增殖。免疫細胞化學結果顯示貼壁生長細胞AMH蛋白陽性表達<5%,而p450scc蛋呈陽性表達>95%;貼壁細胞培養(yǎng)24小時之后雄激素濃度為649.22±12.3ng/dl(n=3),雌激素濃度<10.7pg/ml(n=3);0.1U/ml LH組的睪酮水平明顯高于FSH組和基礎培養(yǎng)基組(p<0.05)。0.5U/ml LH組的睪酮水平顯著高于0.1U/ml組差異均有統(tǒng)計學意義(P

4、<0.05);加入LH0.5U/ml組、1U/ml組,2U/ml組之間睪酮水平未見明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FSH組睪酮水平和基礎培養(yǎng)基組未見明顯統(tǒng)計學差異(p>0.05),在這三組中均未檢測到雌激素水平的改變。
　　結論:通過本實驗的分離和培養(yǎng)方法可以得到大量貼壁生長的卵泡膜間質細胞,其中很少有顆粒細胞的混雜,此方法可以快速、高效的進行小鼠卵泡膜間質細胞的分離培養(yǎng)。
　　第二部分:氧化應激通過P38sapk途徑上調P

5、16基因表達引起卵泡膜間質細胞的衰老
　　目的:探討在卵泡膜間質細胞中氧化應激是否通過P38mapk途徑上調P16基因的表達,從而導致卵巢中卵泡膜間質細胞衰老的發(fā)生。
　　方法:免疫組織化學檢測12周、24周、48周各年齡階段卵巢組織中P38、P16、氧化損傷指標(8-OHdG)的表達變化,蛋白印跡技術檢測P38,P-P38、P16以及氧化損傷指標的表達改變,通過機械法聯(lián)合膠原酶Ⅳ-DNase消化法分離提純卵泡膜間質細胞,C

6、CK8試劑盒檢測細胞的增殖分裂能力,β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老程度,全自動化學發(fā)光免疫分析儀測定不同處理因素細胞激素分泌水平。
　　結果:通過免疫組織化學和蛋白印跡技術發(fā)現(xiàn)卵巢組織中P38,P16,氧化損傷指標主要表達于卵泡膜間質細胞且隨增齡而增加(p<0.05);50umol/L H2O2作用4小時是引起卵泡膜間質細胞衰老的適宜濃度,5mmol/L的NAC可以抵抗50umol/L H2O2的氧化應激,10ug/ml的P38特