口腔鱗狀細胞癌差異基因的篩選驗證及相互作用的生物信息學分析.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分口腔鱗狀細胞癌的基因表達譜芯片檢測
　　目的:本實驗通過基因表達譜芯片檢測口腔鱗狀細胞癌組織與癌旁正常對照組織的基因表達譜，從基因表達譜結(jié)果中篩選出變化明顯的差異基因。
　　方法:在廣東省口腔醫(yī)院收集口腔鱗狀細胞癌患者兩例，每例患者采集口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁正常對照組織作為一組，采用Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片進行口腔鱗狀細胞癌及癌旁正常對照組織的基因

2、表達譜檢測。
　　結(jié)果:按差異基因篩選標準，從32448條檢測基因中篩選出口腔鱗狀細胞癌腫瘤組織的差異基因共有7872條，占篩選基因總數(shù)的24％;其中上調(diào)表達的基因有3800條，下調(diào)表達的有4072條。
　　結(jié)論:通過基因表達譜芯片檢測并根據(jù)表達差異一倍以上的篩選標準得到了7872個表達差異的基因。由此可見腫瘤的發(fā)生發(fā)展不是單個或幾個基因的作用結(jié)果，以往實驗往往針對某個或某幾個基因的研究有很大的局限性。同時也說明了腫瘤的產(chǎn)生

3、是多基因成網(wǎng)絡相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果，而且這個網(wǎng)絡的作用關(guān)系是非常復雜的。
　　第二部分基因表達譜芯片數(shù)據(jù)的生物信息學分析
　　目的:我們通過基因表達譜芯片檢測比較了口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁正常對照組織的基因表達譜差異，為了把這些基因表達譜的數(shù)據(jù)和生物學功能聯(lián)系起來，我們就要對數(shù)據(jù)進行聚類分析。此部分實驗通過對基因表達譜芯片的檢測結(jié)果進行生物信息學分析，找出篩選的差異基因的變化趨勢及相互作用網(wǎng)絡。
　　方法:通過基因表達譜

4、芯片配套軟件Agilent GeneSpring GX v12.0分析第一部分基因表達譜芯片實驗數(shù)據(jù)，進行GO分析和KEGG生物學通路富集分析，找出差異基因的變化趨勢及相互之間的可能作用關(guān)系。
　　結(jié)果:使用基因表達譜芯片配套軟件Agilent GeneSpring GX v12.0進行差異基因功能分類注釋(Gene ontology，GO)分析和基因表達譜芯片數(shù)據(jù)的KEGG生物學通路富集分析，將基因分為上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進行

5、功能富集分析。
　　第一 GO分析口腔鱗狀細胞癌組織與癌旁正常對照組織樣本RNA間的差異基因分布情況如下:
　　1.生物過程部分
　　1.1 上調(diào)基因中生物過程部分:上調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有532個生物過程的亞層，差異表達的基因主要富集于刺激反應(response to stimulus)(6.75)，免疫系統(tǒng)過程（immune system process）(6.06)，細胞外基質(zhì)組織(extracellul

6、ar matrix organization)(5.54)，免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)(regulation ofimmune system process)(5.49)，免疫反應(immune response)(5.39)，器官形態(tài)(organ morphogenesis)(4.88)，細胞外結(jié)構(gòu)組織(extracellular structureorganization)(4.84)，淋巴細胞副刺激(lymphocyte costimul

7、ation)(4.77)，T細胞副刺激(T cell costimulation)(4.77)，細胞活化的正調(diào)節(jié)(positive regulationof cell activation)(4.75)。
　　1.2 下調(diào)基因中生物過程部分:下調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有715個生物過程的亞層，差異表達的基因其中主要集中于:信號(signaling)(9.70),生物調(diào)節(jié)(biological regulation)(9.29)

8、，死亡(death)(9.12)，細胞死亡(cell death)(8.98),細胞過程(cellular process)(8.89)，信號傳導(signal transduction)(8.74)，細胞組成活動(cellular component movement)(8.69)，創(chuàng)傷反應(response to wounding)(8.24),生物質(zhì)量調(diào)節(jié)(regulation of biological quality)(8.1

9、1)，創(chuàng)傷愈合(woundhealing)(7.90)。
　　2.細胞組分(Cellular Component)
　　2.1 上調(diào)基因中細胞組分部分:上調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有41個細胞組分的亞層，差異表達的基因其中主要集中于細胞外區(qū)域部分(extracellularregion part)(12.14)，細胞外區(qū)域(extracellular region)(12.14)，細胞外空間(extracellular s

10、pace)(10.91)，質(zhì)膜部分(plasma membrane part)(7.69)，質(zhì)膜必需的(integral to plasma membrane)(7.50)，質(zhì)膜固有的(intrinsic to plasmamembrane)(7.49)，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix)(6.00)，纖維膠原蛋白(fibrillarcollagen)(5.53)，質(zhì)膜(plasma membrane)(5.02)，

11、細胞周圍(cell periphery)(4.93)。
　　2.2 下調(diào)基因中細胞組分部分:下調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有149個細胞組分的亞層，差異表達的基因其中主要集中于:細胞質(zhì)(cytoplasm)(18.17),細胞質(zhì)部分(cytoplasmic part)(11.18)，細胞內(nèi)部分(intracellular part)(9.07),質(zhì)膜(plasma membrane part)(9.01)，細胞內(nèi)（intracel

12、lular）(8.88)，細胞組成(cell fraction)(8.79)，胞液(cytosol)(8.77)，不溶組成(insoluble fraction)(8.65)，細胞膜組成(membrane fraction)(7.99)，細胞周圍（cell periphery）(7.31)。
　　第二 基因表達譜芯片數(shù)據(jù)的KEGG生物學通路富集分析
　　根據(jù)最新KEGG數(shù)據(jù)庫，我們進行基因表達差異數(shù)據(jù)的pathway分析。<

13、br>　　結(jié)論:通過生物信息學分析我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌差異基因富集于三大類共1666個亞類，主要集中于免疫、細胞結(jié)構(gòu)及信號傳導調(diào)節(jié)等生物過程方面，質(zhì)膜、細胞膜、細胞質(zhì)、膠原蛋白、細胞外區(qū)域等細胞組成方面和與蛋白、糖、酶、激酶、跨膜受體等結(jié)合的細胞功能方面。而這些方面的變化與腫瘤細胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。由此可見腫瘤的發(fā)生發(fā)展不是單個或幾個信號通路的作用結(jié)果，是多個信號通路呈網(wǎng)絡相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果，這個網(wǎng)絡的作用關(guān)系是非常復雜，

14、是參與腫瘤發(fā)生的多信號通路的綜合作用結(jié)果。
　　第三部分口腔鱗狀細胞癌差異基因的熒光定量RT-PCR表達驗證
　　目的:本實驗部分通過第一部分基因表達譜芯片數(shù)據(jù)與實驗組前期蛋白組學實驗構(gòu)建的口腔鱗狀細胞癌52種差異蛋白作用網(wǎng)絡共同分析，篩選出表達變化趨勢相同且差異相對較大的基因，通過熒光定量RT-PCR實驗去驗證這些差異基因在口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁對照組織中的表達，從而確定差異基因的表達及基因表達譜芯片的可靠性，進而研究各

15、差異基因之間的可能作用機制。
　　方法:
　　1.需要進行熒光定量RT-PCR驗證的差異基因的確認方法:在前期課題組經(jīng)典蛋白組學實驗采用Bio-Rad雙向電泳系統(tǒng)進行一向等電聚焦和二向垂直電泳篩選出的52種口腔鱗狀細胞癌差異蛋白中，我們綜合基因表達譜芯片檢測結(jié)果，選擇與52種差異蛋白對應基因變化一致且相對變化較大的基因。我們共選出15個目標基因，其中表達上調(diào)的基因有6個，分別為:GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LG

16、ALS7、EIF5A、TAGLN。表達下調(diào)的基因有9個，分別為:S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、 SERPINB3。
　　2.在廣東省口腔醫(yī)院等多個醫(yī)院收集口腔鱗狀細胞癌患者32例，每例患者采集口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁正常對照組織作為一組，通過熒光定量RT-PCR進行較大樣本的表達驗證。
　　結(jié)果:經(jīng)過熒光定量RT-PCR驗證（GAPDH為內(nèi)參）后，差異基因

17、(GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LGALS7、EIF5A、TAGLN)表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。差異基因（S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、SERPINB3）表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。熒光定量RT-PCR驗證差異基因的變化趨勢與基因表達譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)果具有很好的一致性。
　　結(jié)論:熒光定量RT-PCR技術(shù)是驗證基

18、因表達譜芯片數(shù)據(jù)最精確的技術(shù)，本實驗我們采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對較大樣本量進行驗證，實驗結(jié)果表明熒光定量RT-PCR驗證結(jié)果與基因表達譜芯片結(jié)果一致。鑒于差異基因經(jīng)熒光定量RT-PCR驗證與芯片基因表達一致，認為Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片結(jié)果的可信性較高。通過基因表達譜芯片的檢測和熒光定量RT-PCR的驗證實驗我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌組織具有很多的差異基因、蛋白，而不是一個或者幾個基因發(fā)生改變，也指示我們要研究