ec-SOD基因修飾的BMSCs對心肌細胞的保護作用的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　據(jù)2012中國衛(wèi)生年鑒的統(tǒng)計,我國因心血管疾病的死亡率位于各類疾病之前列,在城市為257.41/10萬,占總死亡率的19.51％,在農(nóng)村為128.13/10萬,占17.45%。盡管隨著溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈介入治療等的策略優(yōu)化,心肌梗死的早期死亡率有明顯降低,但是,缺血再灌注損傷導致的遠期心力衰竭和死亡仍然居高不下,近年來對其有效地防治策略研究越來越被人們重視。氧化應激(oxidative stress,OS

2、)是一種高活性分子產(chǎn)生與機體清除或者修復能力失衡的表現(xiàn),其通過過氧化物和氧自由基的產(chǎn)生破壞細胞的各組成部分,造成細胞毒性破壞細胞正常的氧化還原狀態(tài),直接參與動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展。因此有效降低氧化應激損傷,是早期預防和治療心肌缺血再灌注減低死亡率的關鍵策略之一。
　　細胞外超氧化物歧化酶1982年由Marklund等首次發(fā)現(xiàn)并命名,是超氧化物歧化酶家族中的一種。超氧化物岐化酶是一種抗氧化酶,它可以將兩

3、個自由基歧化為H2O和O2。細胞外超氧化物歧化酶不僅存在于細胞外環(huán)境,而且在一些特定的組織如心臟,血管,肺組織,腎臟和胎盤等中高表達,其生理學功能主要是保護大腦、心臟和其他組織免受氧化應激損傷,減少細胞和組織損傷。
　　基因治療是在1972年首次提出[1],以基因工程技術為手段,導入目的基因修復異常的基因或使其表達相應的蛋白治療疾病的一類新型技術。1990年,美國FDA批準首個基因治療實驗治療重癥綜合免疫缺陷(severe com

4、bined immunodeficiency,SCID)[58]。自此,已進行了超過1700項有關基因治療的臨床試驗。雖然早期臨床失敗導致許多對基因治療的質(zhì)疑,但近年來治療視網(wǎng)膜疾病萊伯氏先天性黑朦(retinal disease Leber's congenital amaurosis)[59-62],SCID[63]和帕金森氏病[64]等臨床試驗的成功為基因治療帶來新的希望。研究證實通過直接注射ec-SOD病毒載體過表達ec-SOD

5、可以減少心肌頓抑和梗死面積。但因作用時間較短和直接注射病毒的安全性而限制了其臨床應用。
　　本研究擬在體外細胞水平,探討ec-SOD(extracellular superoxide dismutase,細胞外超氧化物歧化酶)修飾的BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓間充質(zhì)干細胞)對缺氧復氧條件下乳鼠心肌細胞的保護效應以及潛在作用機制,以期找尋找抗心肌氧化應激損傷的新治療策略。

6、r>　　方法：
　　第一部分:乳鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)鑒定與BMSCs的分離培養(yǎng)鑒定:通過差速貼壁法獲得乳鼠心肌細胞,采用cTnI免疫熒光染色鑒定乳鼠心肌細胞的分離效率;通過貼壁法獲得BMSCs,通過流式細胞計數(shù)鑒定BMSCs的表面標志物。
　　第二部分:觀察ec-SOD修飾的BMSCs對H/R條件下CMs(cardiomyocytes,心肌細胞)的保護作用:1.將CMs分為4組:A常氧對照組(不做缺氧復氧干預);B缺氧對照組

7、(單純進行缺氧復氧干預);C條件培養(yǎng)組(將ec-SOD修飾的BMSCs培養(yǎng)48h的培養(yǎng)基加入CMs并進行缺氧復氧干預);D共培養(yǎng)組(將ec-SOD修飾的BMSCs置于transwell小室中與CMs共培養(yǎng)并進行缺氧復氧干預);檢測1.Elisa法檢測ec-SOD修飾的BMSCs分泌ec-SOD蛋白的水平;2.MTT法檢測H/R條件下CMs的存活率;3.TUNEL法檢測CMs的凋亡率。
　　第三部分:探討ec-SOD修飾的BMSCs

8、對H/R條件下CMs的保護作用機制:將CM分為4組:A常氧對照組;B缺氧對照組;C條件培養(yǎng)組;D共培養(yǎng)組;檢測:1.DHE染色檢測ROS的含量;2.Western blot檢測ec-SOD修飾的BMSCs作用后CMs中p38MAPK和p-p38MAPK表達的變化。
　　結果:
　　1.乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng)后第3d,在倒置相差顯微鏡下可見細胞伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng),呈放射狀排列的同心圓狀,搏動呈同步性,搏動頻率多在100/m

9、in~120/min;cTnI染色鑒定呈陽性。BMSCs經(jīng)培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細胞長梭形、成纖維狀,排列較緊密;經(jīng)流式細胞儀鑒定,其表面標志物CD44、CD90陽性、CD34、CD45陰性。
　　2.ec-SOD修飾的BMSCs通過分泌ec-SOD,可明顯增加CMs在缺氧復氧損傷后的存活率和減少CMs的凋亡。
　　3.ec-SOD修飾的BMSCs能夠明顯減少CMs間的ROS含量,進而減少CMs在缺氧復氧損傷后的p38MA