辛伐他汀和血脂康對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、本研究通過(guò)鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，分別給予辛伐他汀和血脂康治療，擬觀察糖尿病時(shí)大鼠腎臟的結(jié)構(gòu)改變和組成細(xì)胞的凋亡情況，以及辛伐他汀和血脂康對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)功能和細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。
　　 1.材料與方法：
　　 1.1試劑及材料
　　 STZ購(gòu)自Sigma公司，辛伐他汀由默沙東公司饋贈(zèng)，血脂康由北大維信饋贈(zèng)，PAS、Masson染色試劑盒購(gòu)自珠海貝索，TUNEL原位凋亡

2、染色試劑盒購(gòu)自Roche公司，Caspase-9、Bax抗體購(gòu)自Santa cruz，Bc1-2抗體購(gòu)自武漢博士德，細(xì)胞色素c抗體購(gòu)自BD公司。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組
　　 清潔級(jí)雄性Sprague Dawley（SD）大鼠90只，體重180-220克（購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料塊，隨意充分飲水，室內(nèi)保持通風(fēng)和相對(duì)恒溫，保持正常晝夜節(jié)律。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選取70只采用STZ一次性腹腔

3、注射方法建立糖尿病模型，建模前禁食12小時(shí)，注射劑量60mg/kg（溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.2），注射后48小時(shí)及72小時(shí)分別尾靜脈采血，血糖≥16.7mmol/L者為造模成功，正常對(duì)照組注射相應(yīng)體積的檸檬酸緩沖液。糖尿病模型確立后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組：1.辛伐他汀治療組（SIM組，n=22）：每天予辛伐他汀灌胃，給藥劑量20mg/kg；2.血脂康治療組（XZK組，n=22）：每天予血脂康灌胃，給藥劑量1200mg

4、/kg；3.糖尿病組（DM組，n=22）：每天予相應(yīng)體積生理鹽水灌胃。另20只設(shè)為正常對(duì)照組（SD組，n=20），每天予相應(yīng)體積生理鹽水灌胃。建模開(kāi)始后第7天開(kāi)始給藥。
　　 1.3生化指標(biāo)檢測(cè)
　　 給藥3月后每組分別取半數(shù)大鼠處死，給藥6月后處死剩余大鼠。各大鼠處死前放入代謝籠收集24小時(shí)尿，離心后采用散射比濁法（Beckman CoulterImmage800）測(cè)定尿白蛋白。腹腔注射麻醉后稱(chēng)體重，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，B

5、eckmanLX20全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血糖及血脂。
　　 1.4腎臟形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞凋亡情況
　　 用4℃生理鹽水注射液灌洗大鼠腹主動(dòng)脈后，迅速取出雙側(cè)腎臟，右腎去包膜用濾紙吸干血跡后稱(chēng)重，右腎重量（g）/體重（kg）比值為腎重指數(shù)。將右腎對(duì)半剖開(kāi)，其中一半10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，行PAS染色和Masson染色檢測(cè)腎組織內(nèi)糖原及膠原纖維沉積情況，TUNEL法原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞。每例切片高倍鏡下觀察5個(gè)視野并進(jìn)

6、行半定量分析。
　　 1.5腎皮質(zhì)Bax、Bc1-2、Caspase-9、細(xì)胞色素c的表達(dá)
　　 左腎分離皮質(zhì)，-80℃冷凍保存，提取總蛋白行Western Blot檢測(cè)腎皮質(zhì)Bax、Bc1-2和活化的Caspase-9的表達(dá)；右腎剩余一半置于冰上，取皮質(zhì)去除線粒體后提取細(xì)胞漿蛋白，Western Blot方法測(cè)定細(xì)胞色素c表達(dá)。同時(shí)采用免疫組化方法檢測(cè)腎組織內(nèi)Bax及Bc1-2的定位表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。免疫組化圖像

7、分析采用Image Pro Plus（IPP）6.0圖像分析軟件進(jìn)行；Western Blot圖像采集及分析采用化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀及配套軟件進(jìn)行。
　　 1.6統(tǒng)計(jì)方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組數(shù)據(jù)平均值比較采用方差分析（ANOVA），組間比較用Bonferroni分析進(jìn)行。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異定義為P﹤0.05。
　　 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

8、
　　 2.1大鼠一般情況
　　 共70只大鼠接受糖尿病造模，其中66只血糖≥16.7mmol/L，確認(rèn)為造模成功，4只血糖未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。66只糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組，飼養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)血糖，其中7只血糖不達(dá)標(biāo)排除，另有4只死亡，最終各組大鼠數(shù)量為：SD組3月，n=10；SD組6月，n=10；DM組3月，n=9；DM組6月，n=10；SIM組3月，n=10；SIM組6月，n=9；XZK組3月，n=9；XZK組6月，n=8。

9、r>　　 正常對(duì)照組大鼠血糖均低于7mmol/L，尿糖陰性，注射STZ后48小時(shí)及72小時(shí)大鼠血糖明顯升高（≥16.7mmol/L），實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)血糖維持造模標(biāo)準(zhǔn)，辛伐他汀和血脂康對(duì)糖尿病大鼠的血糖沒(méi)有改善作用；實(shí)驗(yàn)期間正常SD大鼠體重逐漸增加，沒(méi)有多飲多尿多食癥狀，而糖尿病大鼠體重增長(zhǎng)緩慢或不增長(zhǎng)，出現(xiàn)較明顯的三多一少等糖尿病常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，辛伐他汀和血脂康治療均未能恢復(fù)糖尿病大鼠的體重。各實(shí)驗(yàn)組大鼠血脂水平未見(jiàn)顯著性差異。
　

10、　 2.2腎重指數(shù)及24小時(shí)尿白蛋白排泄量
　　 糖尿病組3月和6月后腎重指數(shù)出現(xiàn)明顯增加（P﹤0.01），辛伐他汀和血脂康治療后各時(shí)間點(diǎn)腎重指數(shù)均較糖尿病組呈下降趨勢(shì)（P<0.05或P﹤0.01），但仍高于正常對(duì)照組（P﹤0.01），兩種藥物之間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 正常對(duì)照組尿白蛋白排泄量較少，糖尿病造模3月后尿白蛋白排泄明顯增多，6月后進(jìn)一步加重（P﹤0.01）；辛伐他汀和血脂康治療3月和6月后尿白蛋白排泄

11、量較同時(shí)間點(diǎn)的糖尿病組減少（P﹤0.01或P<0.05），但仍高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組（P﹤0.05或P﹤0.01）；辛伐他汀治療組和血脂康治療組間尿白蛋白排泄量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.3腎組織PAS和Masson染色結(jié)果
　　 PAS染色見(jiàn)正常大鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，糖尿病模型組大鼠3月后可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小管基底膜不規(guī)則增厚，腎小球系膜及基底膜區(qū)PAS陽(yáng)性物質(zhì)增多，較正常對(duì)照組有

12、顯著性差異（P﹤0.01），6月后上述區(qū)域PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積進(jìn)一步增多。辛伐他汀治療能逆轉(zhuǎn)大鼠腎臟PAS陽(yáng)性物質(zhì)的沉積增加（P﹤0.01），且與正常對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異（P﹥0.05）；血脂康治療亦能減少糖尿病時(shí)腎臟PAS陽(yáng)性物質(zhì)的沉積（P﹤0.01），但仍高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組（P﹤0.05）。給藥3月時(shí)血脂康治療組腎組織內(nèi)PAS陽(yáng)性物質(zhì)的沉積多于辛伐他汀治療組（P﹤0.05），6月后兩組間未見(jiàn)明顯差異。
　　 Masson

13、染色顯示3月后糖尿病模型組大鼠腎小球及腎小管基底膜區(qū)、腎小球系膜區(qū)膠原纖維沉積較正常對(duì)照組明顯增多，6月后進(jìn)一步加重（P﹤0.01）。辛伐他汀治療3月或6月后腎組織內(nèi)膠原沉積較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的糖尿病模型組均明顯減少（P<0.01），但仍較正常對(duì)照組增多（P﹤0.05）。血脂康治療6月后腎組織內(nèi)膠原沉積較糖尿病模型組顯著減少（P﹤0.01），但治療3月時(shí)血脂康組與糖尿病組未見(jiàn)明顯差異，治療3月或6月后與正常對(duì)照組均存在顯著差異（P﹤0.01）

14、。辛伐他汀治療組膠原沉積少于血脂康治療組，3月和6月時(shí)兩組間均存在顯著性差異（P﹤0.01或P﹤0.05）。
　　 2.4腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果
　　 TUNEL原位凋亡染色顯示正常對(duì)照組大鼠腎臟內(nèi)凋亡細(xì)胞很少，主要位于遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞，糖尿病模型組大鼠腎臟凋亡細(xì)胞明顯增多（P﹤0.01），主要集中于腎遠(yuǎn)曲小管、近曲小管，腎小球亦可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，數(shù)量較腎小管區(qū)域少，隨糖尿病病程延長(zhǎng)腎臟細(xì)胞凋亡逐漸增加。辛伐他汀治療3月和

15、6月后腎臟凋亡細(xì)胞較糖尿病組均明顯減少（P﹤0.01），3月時(shí)與正常對(duì)照組間未見(jiàn)明顯差異，6月時(shí)腎臟凋亡細(xì)胞較正常對(duì)照組增多（P﹤0.05）。血脂康治療3月和6月后腎臟細(xì)胞凋亡較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的糖尿病組明顯減少（P﹤0.01），但均多于正常對(duì)照組（P﹤0.05）。
　　 2.5腎組織內(nèi)Caspase-9和細(xì)胞色素c的表達(dá)情況
　　 Western Blot顯示正常對(duì)照組活化的Caspase-9和細(xì)胞色素c的表達(dá)較少，糖尿病組

16、活化的Caspase-9和細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c的表達(dá)明顯增加，辛伐他汀和血脂康治療組活化的Caspase-9和細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c表達(dá)水平較糖尿病組降低，但仍高于正常對(duì)照組。
　　 2.6腎組織內(nèi)Bax和Bc1-2的表達(dá)情況
　　 免疫組化結(jié)果和Western Blot結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠腎組織中Bax和Bc1-2表達(dá)量較少，糖尿病模型組Bax表達(dá)顯著增加（P﹤0.01），隨著病程延長(zhǎng)逐漸增加；糖尿病組3月時(shí)腎組織中Bc

17、1-2表達(dá)較正常對(duì)照組稍有增加，但未見(jiàn)明顯差異，6月時(shí)Bc1-2表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下降（P﹤0.01），糖尿病組Bax/Bc1-2比值高于正常對(duì)照組（P<0.01），隨病程進(jìn)展進(jìn)一步升高。辛伐他汀和血脂康治療可以明顯抑制糖尿病腎臟組織中Bax表達(dá)的增加，上調(diào)Bc1-2的表達(dá)，從而降低Bax/Bc1-2比值（P<0.01）。
　　 3.結(jié)論：
　　 3.1糖尿病腎病時(shí)腎臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，且隨病程延長(zhǎng)逐步進(jìn)展，辛伐他汀和