透明質(zhì)酸在人早孕期母-胎免疫耐受中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、妊娠是一種同種異體移植，受全身、局部免疫調(diào)節(jié)。成功妊娠反映母體對(duì)胚胎的免疫耐受;母體對(duì)胚胎抗原的免疫排斥則導(dǎo)致妊娠失敗。揭示母-胎免疫耐受的確切機(jī)制，將對(duì)人類自然流產(chǎn)等妊娠疾患的防治具有重要意義。由于母胎免疫耐受是自然界免疫逃逸良好的生理性模型，對(duì)移植免疫學(xué)和腫瘤免疫學(xué)研究將產(chǎn)生積極推動(dòng)作用。
　　母-胎界面主要包括滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞以及蛻膜免疫細(xì)胞。多年來(lái)人們從不同角度研究母-胎界面發(fā)生的生物學(xué)事件，以闡述母

2、-胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其中包括母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì)，及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryT helper cells，Treg）擴(kuò)增及功能機(jī)制。透明質(zhì)酸(Hyaluronan，hyaluronicacid，HA)不僅作為-種廣泛存在的細(xì)胞外基質(zhì)，而且通過(guò)與靶細(xì)胞表面受體CD44結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，參與多種體細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，如增殖，遷移，活化，分化，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附等，還能促進(jìn)多種細(xì)胞因子、趨化因子的分泌。我們研究發(fā)現(xiàn)

3、人早孕期母-胎界面透明質(zhì)酸大量積聚并表達(dá)其受體CD44，因此我們以此為切入點(diǎn)闡明其在母-胎免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制。
　　第一部分透明質(zhì)酸及其受體CD44在人早孕期母-胎界面的表達(dá)及其調(diào)節(jié)
　　目的：分析透明質(zhì)酸及其受體CD44在母-胎界面的表達(dá)特征及妊娠激素對(duì)其調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集早孕期正常或不明原因自然流產(chǎn)的絨毛與蛻膜組織，采用免疫組織/細(xì)胞化學(xué)、Real Time RT PCR、ELISA法、聚丙烯酰胺凝膠電泳

4、和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)母-胎界面HA、HA合成酶(Hyaluronan synthase，HAS)及其受體CD44的表達(dá)特征，并比較HA在正常早孕與流產(chǎn)之間的差別。各種濃度的妊娠相關(guān)激素對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)其HAS表達(dá)和HA的分泌。
　　結(jié)果：免疫化學(xué)法分析顯示，絨毛與蛻膜組織均表達(dá)HA和CD44。HA主要表達(dá)于胞漿和胞外基質(zhì);CD44表達(dá)于胞膜。HA主要由早孕蛻膜胞基質(zhì)細(xì)胞(DSCs)和滋養(yǎng)細(xì)胞(Tros)分泌。1×106 c

5、ells/ml/孔DSCs培養(yǎng)至72 h時(shí)，分泌HA水平達(dá)1032.0±73.83ng/ml，1×106 cells/ml/孔Tros分泌HA峰值達(dá)686.4±57.1ng/ml。正常早孕的HAS2轉(zhuǎn)錄水平、HA分泌水平和平均分子量明顯高于自然流產(chǎn)組，提示HA參與人正常妊娠的維持。17β-E2、孕酮或β-hCG均能促進(jìn)DSCs轉(zhuǎn)錄HAS2和分泌HA。
　　結(jié)論：人母-胎界面表達(dá)HA，DSCs是其主要來(lái)源，并高表達(dá)CD44;正常早孕

6、HA分泌水平和平均分子量顯著高于不明原因自然流產(chǎn)患者，妊娠激素顯著促進(jìn)HA的分泌。
　　第二部分母-胎界面透明質(zhì)酸對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用
　　目的：研究HA對(duì)母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的調(diào)節(jié)作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖、AnnexinⅤ-FITC分析細(xì)胞凋亡、TranswellMatrigel侵襲法分別分析高、中、低分子量的HA對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)

7、胞增殖、凋亡和侵襲的影響。In-cell western檢測(cè)HA活化的胞內(nèi)信號(hào)通路分子，相應(yīng)的信號(hào)通路抑制劑阻斷HA的活化效應(yīng)。
　　結(jié)果：高分子量HA能促進(jìn)DSCs的增殖，抑制其凋亡;而高、中分子量HA能促進(jìn)Tros的增殖，抑制其凋亡。中分子量HA顯示出比高分子量HA更強(qiáng)的促進(jìn)Tros的侵襲效應(yīng)。HA抑制肽和CD44中和性抗體能完全或部分阻斷HA對(duì)DSCs和Tros的生物學(xué)功能的升調(diào)節(jié)作用。高分子量HA能活化PI3K/AKT和M

8、APK/ERK1/2信號(hào)通路，PI3K/AKT抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑U0126阻斷相應(yīng)的信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)HA對(duì)DSCs和Tros的生物學(xué)行為的升調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論：高、中分子量HA能上調(diào)DSCs和Tros的生物學(xué)行為，表現(xiàn)為增殖能力增強(qiáng)，凋亡下降，且Tros侵襲能力增強(qiáng)，有利于維持正常妊娠。PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路參與HA誘導(dǎo)的對(duì)DSCs和Tros的生物學(xué)行為的升調(diào)節(jié)作用。
　　第

9、三部分母-胎界面透明質(zhì)酸誘導(dǎo)CD14+單核巨噬細(xì)胞免疫耐受
　　目的：探討外源性HA及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)CD14+單核巨噬細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)分析蛻膜各種免疫細(xì)胞CD44的表達(dá)水平。磁珠分選外周血和蛻膜局部CD14+單核巨噬細(xì)胞，經(jīng)不同分子量的外源性HA及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)其誘導(dǎo)，流式細(xì)胞術(shù)分析CD14+單核巨噬細(xì)胞膜表面MHC-Ⅱ分子、協(xié)同刺激分子和胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)特征。
　　結(jié)果：

10、在蛻膜免疫細(xì)胞中CD14+巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)CD44。經(jīng)HMW-HA和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激后，外周血及蛻膜CD14+單核巨噬細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)下降，PD-L1和PD-L2表達(dá)上調(diào);但對(duì)HLA-DR和ICOS-L無(wú)顯著影響;HA抑制肽和CD44中和性抗體可抵消HA對(duì)CD14+單核巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。HMW-HA促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β1，而LMW-HA抑制對(duì)外周血CD14+單核細(xì)胞分泌IL-1

11、0和TGF-β1。正常蛻膜CD14+巨噬細(xì)胞較流產(chǎn)蛻膜CD14+巨噬細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)水平下降，IL-12p40分泌減少，PD-L1和PD-L2上升，IL-10和TGF-β1水平增加。
　　結(jié)論：HMW-HA和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)CD14+單核巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)免疫耐受表型。
　　第四部分透明質(zhì)酸通過(guò)訓(xùn)導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)naive CD4+T細(xì)胞向Th2及Treg細(xì)胞分化
　　目的：探討HMW-HA及DCM訓(xùn)導(dǎo)

12、的單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞的分化。
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)分析與同個(gè)體HMW-HA或DCM訓(xùn)導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的na(i)ve CD4+T細(xì)胞膜協(xié)同刺激分子受體、胞內(nèi)細(xì)胞因子和核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：HMW-HA和DCM訓(xùn)導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞上調(diào)CTLA-4和PD-1的表達(dá)，但對(duì)CD28和ICOS無(wú)顯著影響;上調(diào)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)錄因

13、子GATA-3的表達(dá)，下調(diào)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，母-胎局部呈Th2免疫偏移;且上調(diào)CD4+T細(xì)胞TGF-β1和Foxp3的表達(dá)，有利于Treg擴(kuò)增和功能增強(qiáng);但對(duì)ICD4+T細(xì)胞IL-17A無(wú)明顯影響，對(duì)RORγt有下調(diào)趨勢(shì)。
　　結(jié)論：HMW-HA和DCM訓(xùn)導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞向Th2和Treg細(xì)胞分化，促進(jìn)母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì)和免疫耐受。
　

14、　小結(jié)：母-胎界面蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞分泌HA以高分子量為主，并表達(dá)其受體CD44，HMW-HA和MMW-HA通過(guò)PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為，有利于胚胎著床和胎盤(pán)形成。 HMW-HA和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清能訓(xùn)導(dǎo)CD14+的單核巨噬細(xì)胞升調(diào)節(jié)負(fù)性協(xié)同刺激分子，降調(diào)節(jié)正性協(xié)同刺激分子，同時(shí)高分泌IL-10和TGF-β1，通過(guò)調(diào)控經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)同個(gè)體的na(i)ve CD4+T細(xì)胞向T