穩(wěn)定整合靶向性14-3-3ζ基因RNA干涉載體的膠質(zhì)瘤細胞系建立.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是一類常見的原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，嚴重威脅人類的健康和生命，是當前神經(jīng)科學迫切需要解決的問題。目前大部分惡性膠質(zhì)瘤的預后很差，盡管在早期診斷、手術治療和放射治療方面已有長足發(fā)展，但其中位生存期只有14個月，并且5年生產(chǎn)率不足2％。另外，由于大部分治療并非選擇性針對腫瘤細胞導致很多正常腦組織也受到損傷，所以對于膠質(zhì)瘤的治療不但需要殺死所有腫瘤細胞，還需要有足夠的能力分辨正常組織和腫瘤細胞。
　　14-3-3蛋白屬于小分

2、子多功能酸性二聚體蛋白，在幾乎所有真核細胞中均有表達，具有高度的保守性。14-3-3蛋白通常在胞質(zhì)中，但是也存在胞核、高爾基體和細胞膜中。哺乳動物細胞中有7個亞型(ζ，β，η，ε，θ，γ和σ)，另外還有兩種在酵母菌和果蠅中，15種在擬南芥植物屬。14-3-3蛋白α和δ分別是β和ζ的磷酸化形式。14-3-3蛋白作用機理非常多，在不同的細胞信號通路中有超過200個14-3-3配體分子與其結合。同時14-3-3蛋白在細胞凋亡、DNA復制、細胞

3、分化、增殖、細胞轉(zhuǎn)化、信號傳導和細胞周期調(diào)控等過程中發(fā)揮了重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在正常膠質(zhì)細胞中低表達，而在膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤組織中高表達，而14-3-3ζ亞型在膠質(zhì)瘤細胞中呈明顯的高表達。目前，靶向14-3-3ζ的膠質(zhì)瘤基因治療實驗研究報道較少?；诖?，本課題在此方向進行了探討。
　　一、人14-3-3ζ基因shRNA真核表達載體pSilencer-14-3-3ζ的構建和鑒定
　　采用Primer5.

4、0軟件，根據(jù)人14-3-3ζ的cDNA序列和干涉載體的設計要求，設計兩條核苷酸鏈序列。每條長64nt，兩端分別含有BamHI和HindIII的酶切位點。將合成的兩條寡核苷酸退火后形成的雙鏈DNA片段從BamHI和HindIII兩個酶切位點克隆到質(zhì)粒載體pSilencer3.1-H1neo載體中，新的質(zhì)粒命名為pSilencer-14-3-3ζ。雙酶切鑒定及測序，證明克隆正確。
　　二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立
　　構建好干涉載體

5、pSilencer-14-3-3ζ和陰性對照載體通過脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染入人類膠質(zhì)母細胞瘤系U251中，進行細胞克隆。隨機挑選30個克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)，備后用。
　　三、Westernblot與RT-PCR檢測14-3-3ζ蛋白表達水平
　　通過Westernblot和RT-PCR檢測，干涉載體pSilencer-14-3-3ζ組細胞的14-3-3ζ蛋白和RNA表達水平有顯著抑制，與陰性對照載體組細胞及U251平行