應(yīng)用重組ALV-J gp85干酪乳桿菌多克隆抗體檢測(cè)J亞型禽白血病間接ELISA方法的建立.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J)自1988年從肉雞中分離出來，在世界范圍內(nèi)廣泛流傳。以垂直和水平兩種傳播方式傳播，誘發(fā)腫瘤、引起生長(zhǎng)緩慢、消瘦、死亡為特征。在種雞上還可降低產(chǎn)蛋率、受精率、孵化率。同時(shí)患病雞骨髓、胸腺、法氏囊發(fā)育受阻導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫抑制，不能產(chǎn)生足夠的抗體應(yīng)對(duì)疾病，導(dǎo)致疫苗免疫失效，易于患病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，該病在我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)中呈現(xiàn)流行趨勢(shì)

2、，優(yōu)質(zhì)地方土雞、三黃雞、商品蛋雞中都有發(fā)病情況報(bào)道。目前臨床上尚無(wú)有效的藥物和疫苗能夠用于此病的治療，鑒于上述原因只有通過淘汰ALV-J陽(yáng)性雞，建立無(wú)ALV-J病原的凈化雞群，才是解決當(dāng)前問題的唯一手段。因此，建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)出血清中的病毒，及時(shí)淘汰帶毒雞對(duì)防制該病流行、開展種群凈化具有重要意義。
　　根據(jù)大多數(shù)病毒和細(xì)菌都是通過消化道和呼吸道的黏膜侵入動(dòng)物機(jī)體的特性，利用重組活載體疫苗，采用口服免疫的方式把表達(dá)的抗原呈

3、遞到黏膜組織，以此來誘導(dǎo)全身的免疫應(yīng)答來抵抗外界的細(xì)菌、病毒的入侵。乳酸桿菌作為一種自然界分布極為普遍，并廣泛分布于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的具有益生保健作用的菌類，近年來乳酸菌口服疫苗已成為研制的熱點(diǎn)。重組的乳酸菌通過天然的形式口服介導(dǎo)黏膜免疫，方法簡(jiǎn)便、安全，不僅在局部黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可介導(dǎo)全身性的免疫應(yīng)答。當(dāng)把重組的含外源基因表達(dá)載體的乳酸桿菌作為活載體菌株時(shí)，能將乳酸桿菌的生物學(xué)特性和外源性抗原基因的免疫原性相結(jié)合，同時(shí)具有表達(dá)的外源蛋白

4、不易受內(nèi)毒素的影響、無(wú)包涵體并易于表達(dá)到細(xì)胞外的特點(diǎn)。重組的菌株易于保存擴(kuò)繁，也符合新型基因工程口服疫苗的特點(diǎn)。
　　本研究使用的方法是通過重組GP85囊膜糖蛋白的干酪乳桿菌口服免疫小白鼠，誘導(dǎo)小白鼠產(chǎn)生特異性抗體，免疫接種后每周檢測(cè)抗體水平。6W后經(jīng)瓊脂雙擴(kuò)散法、Western-blot、直接ELISA檢測(cè)合格的鼠抗ALV-J多抗，經(jīng)提存后對(duì)此抗體進(jìn)行酶標(biāo)，作為酶標(biāo)抗體。并利用本實(shí)驗(yàn)室保存的鼠單抗作為捕獲抗體包被ELISA板，鼠

5、多抗作為酶標(biāo)二抗，建立雙抗夾心ELISA方法。并對(duì)雙抗夾心ELISA方法工作條件進(jìn)行優(yōu)化，來檢測(cè)經(jīng)DF1傳代培養(yǎng)后禽血清中ALV-J。結(jié)果表明，封閉液濃度為5％的脫脂奶粉;單抗包被量為1μg/mL;酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶1600;二抗作用時(shí)間為1h;底物顯色時(shí)間為15min。經(jīng)特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、靈敏性實(shí)驗(yàn)和臨界值確定結(jié)果顯示，該方法具有良好的特性，與新城疫病毒、馬立克病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性支氣管炎病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，并通過對(duì)