JWA調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移的分子機制.pdf

1、目的：探討JWA基因在腫瘤細胞遷移過程中的作用以及相關的分子機制，為進一步深入了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后，為腫瘤的預防、診斷和治療提供新的科學依據(jù)。 方法：HeLa(人宮頸癌細胞)、B16(小鼠黑色素瘤細胞)以及HCCLM3(高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞)都是體外研究腫瘤細胞遷移和侵襲的良好實驗模型。本研究利用這些細胞在特定的促癌或抑癌劑誘導下細胞骨架肌動蛋白絲重組和遷移能力改變的特性，建立系列體外遷移模型。 結果：

2、(1)JWA是新的微管相關蛋白，為了解JWA是否類似于傳統(tǒng)的MAP，具有肌動蛋白絲結合蛋白的功能，用JWA反義寡核苷酸處理細胞，經(jīng)G418篩選后，得到穩(wěn)定的JWA表達缺陷水平的HeLa細胞株(As-HeLa細胞)，再觀察對細胞肌動蛋白絲重組的影響。結果顯示在穩(wěn)定JWA表達缺陷的HeLa細胞株中，肌動蛋白絲開始重組，細胞的邊緣隨之伸出一些突觸，提示JWA可能是微管和肌動蛋白絲結合蛋白，調(diào)節(jié)細胞骨架組裝。 (2)在此基礎上，進一步利

3、用促癌劑佛波酯(phorbol ester, PMA)和抑癌劑三氧化二砷(arsenic trioxide，AS<,2>O<,3>)分別誘導HeLa細胞株肌動蛋白絲重組的細胞模型：8nMPMA分別處理細胞6，12和24h，免疫熒光顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JWA空載體(HteLa-vector細胞)的細胞株中，PMA處理6h后，細胞邊緣仍未發(fā)現(xiàn)突觸的形成，肌動蛋白絲并未出現(xiàn)解聚，提示空載體細胞的肌動蛋白絲未發(fā)生明顯的解聚聚合。而PMA處理12h后

4、，觀察到細胞學形態(tài)發(fā)生改變，肌動蛋白絲開始重組。 (3)為了解JWA是否參與腫瘤細胞的遷移，HeLa細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1，pEGFP-C1-JWA或pEGFP-C1-AsJWA質(zhì)粒，G418穩(wěn)定篩選后，得到空載體，JWA高表達(HeLa-JWA細胞)和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，免疫印跡鑒定，建立劃痕和細胞穿孔試驗模型，觀察JWA對細胞遷移能力的影響。在劃痕模型中結果顯示，JWA表達缺陷可促進細胞的傷口愈合，而JWA高表達則

5、抑制傷口的愈合，表明JWA在細胞的非定向遷移中起作用。同樣，細胞穿孔實驗結果顯示，JWA表達缺陷可促進細胞的遷移，而高表達的細胞則起抑制遷移的作用，表明JWA在細胞的定向遷移中起作用。我們用細胞穿孔模型檢測了在HCCILM3和B16細胞株中JWA的作用，結果觀察到類似的現(xiàn)象，進一步提示JWA在腫瘤細胞的遷移中起重要的作用，JWA可抑制細胞的遷移。 (4)為建立AS<,2>O<,3>誘導細胞遷移的模型，首先用細胞增殖分析試劑盒分析

6、AS<,2>O<,3>的細胞毒性。結果顯示，不同濃度的．AS<,2>O<,3>處理空載體和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細胞48h后，有血清處理的細胞均出現(xiàn)明顯的細胞毒性，2 μM AS<,2>O<,3>處理的HeLa細胞大約50％出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象；但在無血清的情況下，AS<,2>O<,3>濃度低于2μM誘導并未觀察到抑制增殖和促進凋亡現(xiàn)象。 (5)不同濃度AS<,2>O<,3>對細胞遷移作用有著不同的影響：用0.5，1和2μM

7、AS<,2>O<,3>處理空載體細胞0，1和2d后，劃痕結果顯示AS<,2>O<,3>有顯著抑制HeLa細胞傷口愈合的作用，且呈劑量依賴性關系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PMA(80nM)能夠顯著增強AS<,2>O<,3>抑制細胞遷移的作用，而對AS<,2>O<,3>誘導的細胞凋亡和生長抑制沒有顯著影響。 (6)為探討JWA參與細胞遷移的調(diào)控機制，考慮到藥物誘導遷移的有效性及對細胞的毒性作用，選用PMA(80nM)與1 μM AS<,2>

8、O<,3>序貫處理空載體和反義JWA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細胞。結果表明PMA能夠顯著增強HeLa細胞的遷移能力，而AS<,2>O<,3>則明顯抑制PMA誘導的HeLa細胞遷移，JWA基因表達下調(diào)后，能顯著減弱AS<,2>O<,3>對HeLa細胞遷移的抑制作用，同時促進PMA誘導的細胞遷移，這些結果進一步證明JWA可能作為信號分子參與細胞遷移的信號通路調(diào)控。 (7)在此基礎上，為了解JWA是否為模型藥物誘導的細胞遷移信號通路所必須，

9、在上述藥物誘導遷移的細胞模型中，用westem blot檢測絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路級聯(lián)中各級信號分子，結果顯示在AS<,2>O<,3>和PMA影響HeLa細胞遷移模型中，Raf-MEK-ERK．信號途徑被激活(即Raf、MEK、ERK磷酸化)，JWA基因表達下調(diào)后，MEK和ERK不能被磷酸化，但Raf的磷酸化未受到影響. (8)為闡明JWA

10、在模型藥物激活的MEK-ERK信號通路中的作用，本文設計了JWA回復模型。JWA表達缺陷的HeLa細胞瞬轉(zhuǎn)pEGFP-C1-JWA的質(zhì)粒后得到JWA回復的HeLa細胞(As-HeLa-rescue細胞)?；貜湍Ｐ椭?，PMA(80 nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1 μM)處理空載體和JWA回復的細胞24h后，用westem blot檢測Raf-MEK-ERK的磷酸化。結果顯示，JWA回復細胞中，AS<,2>O<,3>和PMA誘導的

11、MEK-ERK信號途徑被激活，MEK和ERK的磷酸化被回復，但Raf的磷酸化回復并未受到影響，進一步證明JWA通過MEK-ERK級聯(lián)影響細胞遷移。 (9)PMA和AS<,2>O<,3>獨立作用時均能激活MEK/ERK信號通路，但兩者對HeLa細胞遷移的影響完全相反(PMA促進遷移，AS<,2>O<,3>抑制遷移)。為了解JWA是否參與激活了ERK不同的磷酸化位點，進而激活其下游不同的底物，我們用westem blot檢測了遷移模

12、型中AS<,2>O<,3>和PMA誘導的ERK下游不同的底物黏著斑激酶(focal adhesionkinase，F(xiàn)AK)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達。結果顯示AS<,2>O<,3>可下調(diào)FAK的表達水平而PMA可上調(diào)COX-2的表達水平。進一步檢測JWA在PMA調(diào)節(jié)COX-2的表達和AS<,2>O<,3>調(diào)節(jié)FAK表達中的作用，結果顯示，在AS<,2>O<,3>和PMA影響HeLa細胞遷移模型中，

13、用PMA(80 nM)處理JWA表達缺陷細胞株后，其相應的ERK下游底物COX-2的表達水平顯著上調(diào)。而AS<,2>O<,3>(1μM)處理則引起其相應的ERK下游底物FAK表達的上調(diào)。這些結果證明JWA與PMA/AS<,2>O<,3>激活的MEK-ERK通路，分別調(diào)節(jié)其相應的ERK下游底物COX-2/FAK的表達，最終引起遷移的不同效應。 (10)用JWA回復模型進一步驗證JWA在PMA調(diào)節(jié)COX-2的表達和AS<,2>O<,

14、3>調(diào)節(jié)FAK表達中的作用。用PMA(80 nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1 μM)處理空載體和JWA回復的細胞24h后，用western blot檢測COX-2和FAK的表達。結果顯示，隨著JWA表達水平的回復，COX-2和FAK的表達均被回復。以上結果提示JWA在PMA和AS<,2>O<,3>誘導的MEK-ERK-下游底物通路中起重要作用。 (11)為探討JWA是否在MAPK級聯(lián)中起類似激酶分子的作用，本文設計了系列

15、JWA磷酸化位點突變體。利用基因突變技術，構建了JWA編碼區(qū)PKC磷酸化位點l、2以及兩位點同時突變的三種pEGFP-N1載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，獲得相應的三種HeLa細胞株，分別命名為As-HeLa-P1，As-HeLa-P2和As-HeLa-P12細胞株。結果說明JWA在AS<,2>O<,3>和PMA引起的MEK-ERK通路中起重要作用，提示JWA在MAPK通路中可能是介于Raf和MEK的磷酸化底物。 (12)為進一步證實JWA磷酸

16、化在遷移中所起的作用，用PMA(80nM)加或不加AS<,2>O<,3>(1μM)分別處理As-HeLa-P12和As-HeLa-rescue細胞后，細胞穿孔試驗檢測其遷移能力的改變。結果顯示，在As-HeLa-rescue細胞中，AS<,2>O<,3>和PMA誘導的遷移被回復，As-HeLa-P12細胞中結果則相反。因此，JWA蛋白磷酸化位點突變對調(diào)節(jié)細胞遷移起著重要的作用，但確切證據(jù)有待進一步研究提供。 討論：JWA 參與腫

17、瘤細胞遷移的調(diào)節(jié)，是促癌或抑癌劑誘導細胞遷移信號轉(zhuǎn)導通路中共同的信號分子，在MAPK信號通路以及肌動蛋白絲的重組過程中起重要的作用。JWA可能是細胞內(nèi)控制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移新的分子標志物。JWA可以抑制HeLa,HCCLM3和B16等腫瘤細胞的遷移，可能在信號通路中同時調(diào)控微管和肌動蛋白絲兩大細胞骨架系統(tǒng)，引起遷移。在HeLa細胞中，JWA通過調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白絲的重組抑制細胞的遷移；在抑癌劑AS<,2>O<,3>和促癌劑PMA誘導的肌動蛋