磷酸肌醇3-激酶信號(hào)通路參與肺損傷修復(fù)及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分 PI3K抑制劑對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 目的：探討磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinases，PI3K)抑制劑對(duì)肉毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，并比較不同的給藥方式、給藥劑量、藥物種類(lèi)以及不同時(shí)間點(diǎn)的療效差別。
　　 方法：取6-8周齡的雄性CD-1小鼠，連續(xù)3天分別經(jīng)鼻(0.5mg/kg)或經(jīng)胃管(50mg/

2、kg)滴入3種不同的PI3K抑制劑(LY294002，SHBM009，GDC0941)或PBS，隨后經(jīng)氣道滴入LPS(1.25mg/kg)誘導(dǎo)肺損傷，分別在LPS滴入后4h和24h處死小鼠(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只)。觀察這3種PI3K抑制劑對(duì)LPS刺激后小鼠肺毛細(xì)血管通透性、肺組織重量/體重比值、肺組織氣體容量(excised lunggas volume，ELGV)、肺泡灌洗液蛋白滲出和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡灌洗液(Brochoalveol

3、ar lavage fluid，BALF)炎癥因子水平的影響，并比較不同給藥方式、不同時(shí)間點(diǎn)的療效差別。A549上皮細(xì)胞分別在含有不同濃度SHBM1009(1或10 ug/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用LPS(1ug/ml)或PBS刺激。在刺激后3，6，12，24收集培養(yǎng)液上清，4℃離心10000rpm10min，用ELISA方法測(cè)定培養(yǎng)液上清中角質(zhì)細(xì)胞源性趨化因子(KC)、白三烯B4(LTB4)的水平。
　　 結(jié)果：LPS刺激后

4、4h和24h小鼠肺組織重量/體重的比值明顯高于PBS刺激組(P<0.01)，經(jīng)鼻或經(jīng)胃管滴入LY294002或GDC-0941能抑制肺組織重量/體重比值的升高(P<0.05)，具有保護(hù)作用。經(jīng)鼻滴入SHBM1009亦具有明顯保護(hù)作用(P<0.01)。經(jīng)鼻滴入LY294002或SHBM1009能明顯抑制LPS刺激4h或24h后ELGV的增加(P<0.05)。經(jīng)鼻滴入這3種PI3K抑制劑均能抑制LPS刺激后4h肺泡灌洗液的白細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0

5、.01或0.05)。LPS刺激能明顯增加4h和24h小鼠肺泡灌洗液角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(KC)的含量(P<0.01)，只有SHBM1009經(jīng)鼻滴入4h組顯示出明顯抑制作用(P<0.01)。利用伊文思藍(lán)染色證明LPS能增加肺泡毛細(xì)血管通透性(P<0.01)，而經(jīng)鼻滴入SHBM1009具有明顯保護(hù)作用(P<0.05)。通過(guò)肺組織免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻滴入SHBM1009能抑制LPS所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞(P<0.01)和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)(P<0.0

6、5)。經(jīng)LPS刺激的氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中KC的水平在3-24h均有明顯升高，而SHBM1009(1ug/ml和10ug/ml)能顯著抑制上皮細(xì)胞分泌KC，且呈劑量依賴(lài)性(P值分別為P<0.05和P<0.01)。LPS刺激后24h，上清液中LTB4和LTB4的水平也有明顯升高。
　　 結(jié)論：PI3K抑制劑能預(yù)防LPS所導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷，主要通過(guò)保護(hù)毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障、抑制上皮細(xì)胞活化、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和黏附能力、減少炎癥因子

7、釋放等。局部給藥的保護(hù)作用優(yōu)于全身給藥，且不同PI3K抑制劑的保護(hù)作用也有差異，這可能和藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、靶向部位以及藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。
　　 第二部分 PI3K抑制劑對(duì)慢性氣道炎癥、組織損傷和氣道重塑的治療作用
　　 目的：探討PI3K抑制劑對(duì)胰彈性蛋白酶(pancreatic elastase，PE)所誘導(dǎo)的大鼠慢性氣道炎癥、組織損傷和氣道重塑的治療作用。
　　 方法：取180-200g的健康雄性Wistar大鼠

8、，氣道滴入PE(250 IU/kg)誘導(dǎo)肺損傷模型，在隨后的7天或28天內(nèi)經(jīng)鼻滴入PBS、SHBM1009或布地奈德(budesonide，Bud)觀察其治療作用。實(shí)驗(yàn)共分為6組：1)Sham組：PBS刺激+PBS治療；2)Vehicle組：PE刺激+PBS治療；3)SHBM1009對(duì)照組：PBS刺激+SHBM1009(10mg/kg)；4)SHBM1009低劑量組：PE刺激+SHBM1009(1mg/kg)；5)SHBM1009高劑量

9、組：PE刺激+SHBM1009(10mg/kg)；6)Bud組：PE刺激+Bud(10mg/kg)。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。通過(guò)HE染色、電鏡、Masson染色觀察大鼠肺組織病理變化，同時(shí)測(cè)定大鼠ELGV、肺組織密度、肺組織重量/體重、BALF蛋白含量和細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA方法檢測(cè)肺泡灌洗液炎癥因子IL-1β水平，RT-PCR方法檢測(cè)肺組織Fibulin-5的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)部分，A549細(xì)胞以合適密度接種于24孔培養(yǎng)板，以不同濃度PE(

10、0.03U/ml，0.3U/ml，1U/ml，2U/ml)或Vehicle刺激與不同濃度的SHBM1009(0.01umol/L，0.1umol/L，1umol/L，10umol/L)或BE2235(0.01umol/L，0.1umol/L，1umol/L，10umol/L)共培養(yǎng)，Cell-IQ細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)觀察48h內(nèi)細(xì)胞增生、分裂和凋亡情況。
　　 結(jié)果：組織病理學(xué)HE染色可見(jiàn)PE刺激后28天，肺泡壁斷裂，肺泡腔明顯擴(kuò)大

11、，電鏡觀察可發(fā)現(xiàn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞微結(jié)構(gòu)變化、間質(zhì)膠原沉積及成纖維細(xì)胞增生、氣血屏障破壞，Masson染色可見(jiàn)Vehicle治療組膠原含量明顯增多，而SHBM1009或Bud治療能保護(hù)肺組織結(jié)構(gòu)的破壞。Vehicle治療組在7天和28天肺組織重量和ELGV值較Sham組和SHBM1009對(duì)照組明顯升高(分別為P<0.05和P<0.01)。PE刺激能誘導(dǎo)肺組織重量增加，雖SHBM1009(1mg/kg)和Bud(10mg/kg)治療組在第7

12、天和28天肺組織重量較vehicle治療組明顯減輕，但與Sham組相比仍有明顯升高(P<0.05 or0.01)。在PE刺激后第7天，大鼠肺組織密度明顯升高，第28天時(shí)，肺組織密度明顯減輕，SHBM1009或Bud治療具有明顯保護(hù)作用(P<0.01)。PE刺激后第7天，Vehicle組肺泡灌洗液蛋白含量明顯增加(P<0.01)，SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P<0.05 orP<0.01)。PE刺激后第7天和第28天，

13、BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.01)，SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P<0.05 or0.01)。PE刺激能誘導(dǎo)BALF炎癥因子IL-1β水平的升高，SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P<0.05 or0.01)。Fibulin-5 mRNA的水平在Vehicle組明顯升高，SHBM10091mg/kg或10mg/kg治療組在第28天均顯示出治療作用，Bud治療組在第7天和28天均顯示出治療作用。PE

14、刺激能明顯抑制氣道上皮細(xì)胞的增生和分裂，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)，而對(duì)細(xì)胞凋亡的影響較小。當(dāng)PE濃度為1U/ml時(shí)，BEZ235在濃度0.1-1.0 uM或SHBM1009在濃度0.01-10 uM具有明顯保護(hù)作用。而當(dāng)PE濃度為0.3U/ml時(shí)，BE22350.01或0.1uM/ml或SHBM10090.01-1.0 uM時(shí)保護(hù)作用較明顯。
　　 結(jié)論：PI3K參與了肺損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，包括早期的炎癥反應(yīng)、肺水腫，以及后期的

15、組織修復(fù)、氣道重塑和肺氣腫，其機(jī)制主要通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增生分裂，修復(fù)損傷的上皮，并能抑制成纖維母細(xì)胞增生和膠原沉積，從而減輕氣道重塑。PI3K抑制劑可能成為慢性氣道疾病的一個(gè)治療的新靶點(diǎn)。
　　 第三部分 KGF-2對(duì)大鼠原位肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 目的：探討角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)對(duì)大鼠原位肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障

16、功能的影響。
　　 方法：健康雄性SD大鼠250g左右，分成6組，每組15只，分組如下：1)Sham組：手術(shù)開(kāi)胸但不經(jīng)歷缺血-再灌注；3)缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)組(I/R)：動(dòng)物經(jīng)開(kāi)胸后，左肺門(mén)夾閉60min，再灌注180min；3)，4)和5)KGF-2低、中、高劑量治療組：動(dòng)物在手術(shù)前72h氣道滴入KGF-22.5 mg/kg，5 mg/kg和10 mg/kg，之后行缺血再灌注手術(shù)；6)

17、地塞米松(dexamethasone，DXM)組：在缺血再灌注手術(shù)前2h腹腔注射地塞米松5 mg/kg。在缺血再灌注損傷前后分別采集血標(biāo)本行血?dú)夥治?，?dòng)物處死后HE染色行肺組織形態(tài)學(xué)測(cè)量，計(jì)算肺濕干重比值，收集肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白水平檢測(cè)，肺組織提取RNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)分析。體外培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonarymicrovascular endothelial cell，HPMEC)進(jìn)一步探討KG

18、F-2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。Cell-IQ、Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KGF-2對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響；FITC標(biāo)記白蛋白的通透性及跨膜電阻抗檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。
　　 結(jié)果：肺組織形態(tài)學(xué)觀察顯示IR組肺組織出血、水腫和炎癥反應(yīng)明顯較Sham組嚴(yán)重，KGF-2和DXM均具有預(yù)防作用，其中KGF-22.5mg/kg和5mg/kg的保護(hù)作用最明顯(P<0.01)。IR組肺組織濕/干重比值明顯增大，KGF-22.5mg/kg、5m

19、g/kg和DXM Smg/kg具有保護(hù)作用(P<0.05)。缺血再灌注之前，所有組血氧分壓無(wú)明顯差別，IR之后，IR組、KGF-210mg/kg組及DXM組血氧分壓均明顯降低(P<0.05)，而KGF-22.5mg/kg和5mg/kg預(yù)處理顯示出明顯保護(hù)作用(P<0.05)。IR之后，大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白水平均明顯增加，KGF-2和DXM均顯示出不同程度的保護(hù)作用(P<0.05或P<0.01)。RT-PCR檢測(cè)顯示KGF-2能促