腸道派氏結(jié)嗜酸性粒細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及其黏膜免疫調(diào)控功能與機制的研究.pdf

1、背景和立題依據(jù):由病原微生物感染引起的傳染病是人類健康和生命的主要威脅之一。目前發(fā)現(xiàn)，90％以上的人類傳染病經(jīng)由黏膜途徑感染。然而，黏膜抗感染免疫機制至今不明。黏膜抗感染免疫不同于系統(tǒng)免疫，與系統(tǒng)免疫系統(tǒng)相比，黏膜處于一個長期帶菌的環(huán)境，接觸不同來源和性質(zhì)的抗原，這就要求黏膜免疫系統(tǒng)對有害抗原和無害抗原具有區(qū)別能力，并反饋為不同的免疫反應(yīng)。對于食物，正常菌群等無害抗原，腸道黏膜免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為免疫耐受，避免發(fā)生超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病，而

2、與無害抗原相反，腸道內(nèi)的病原體等有害抗原可以被腸道黏膜免疫系統(tǒng)識別，并引起免疫應(yīng)答。然而，黏膜免疫的機制至今不明。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體免疫系統(tǒng)中最大也是最為復(fù)雜的部分，也最具有代表性。大量研究數(shù)據(jù)揭示，腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫耐受機制主要有調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Treg)介導，而誘導性Treg的產(chǎn)生與腸道黏膜微環(huán)境密不可分，這種特殊聯(lián)系來源于腸道黏膜免疫系統(tǒng)的幾種細胞或細胞亞群分泌的維甲酸。上述資料提示，腸道

3、具有分泌維甲酸能力的細胞或細胞亞群可能在腸道免疫耐受機制中發(fā)揮了重要作用。
　　研究內(nèi)容及意義:本文通過研究腸道派氏結(jié)中不同樹突狀細胞亞群維甲酸合成限速酶——醛脫氫酶活性來篩選誘導腸道免疫耐受的免疫細胞，研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達醛脫氫酶活性的未知細胞，鑒定結(jié)果是嗜酸性粒細胞，并定量檢測這群腸道嗜酸性粒細胞維甲酸的分泌量，腸道嗜酸性粒細胞Treg誘導相關(guān)的細胞因子——TGF-β和IL-2分泌量，以及腸道嗜酸性粒細胞與初始型T細胞

4、共培養(yǎng)后，T細胞的分化方向。為了檢測非黏膜來源的嗜酸性粒細胞是否具有誘導初始型T細胞向Treg分化的能力，分離純化外周血嗜酸性粒細胞，鑒定外周血嗜酸性粒細胞的表型，外周血嗜酸性粒細胞的維甲酸分泌量，以及外周血嗜酸性粒細胞與初始型T細胞共培養(yǎng)后，Treg的表達情況。以期待揭示嗜酸性粒細胞在腸道黏膜免疫中的功能和機制。
　　研究方法:本文采用美天尼磁珠分選和流式細胞分選來收集和純化野生型小鼠腸道黏膜中的樹突狀細胞以及腸黏膜和外周血中嗜

5、酸性粒細胞;流式細胞儀檢測醛脫氫酶活性檢測試劑標記的細胞的醛脫氫酶活性;流式細胞檢測細胞表型鑒定和瑞氏染色形態(tài)學鑒定高表達醛脫氫酶活性細胞的細胞類型;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量檢測腸道黏膜以及外周血來源的嗜酸性粒細胞的維甲酸分泌量;ELISA檢測腸道黏膜以及外周血來源的嗜酸性粒細胞單獨培養(yǎng)上清中TGF-β和IL-2的濃度;純化的腸道黏膜或外周血來源的嗜酸性粒細胞與純化的CD4+CD62L+OT-II CD4+初始型T細胞共培養(yǎng)數(shù)天后，流式細

6、胞儀檢測CD4+細胞中CD25+Foxp3+Treg細胞的比例，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-4，IL-17，IFN-γ, TGF-β and IL-2的濃度。
　　實驗結(jié)果:實驗結(jié)果表明，腸道派氏結(jié)中，存在一群高表達醛脫氫酶的細胞，經(jīng)表型和形態(tài)學鑒定確認為嗜酸性粒細胞，經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用定量檢測腸道嗜酸性粒細胞培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)這群腸道嗜酸性粒細胞分泌高濃度維甲酸，采用ELISA檢測上清，證明這群腸道嗜酸性粒細胞同時也分泌TGF-β

7、。將腸道嗜酸性粒細胞與初始型T細胞共培養(yǎng)后，流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，6.52％CD4+T細胞表達CD25+Foxp3+，說明初始型T細胞向Treg方向分化。為了驗證非黏膜來源的嗜酸性粒細胞是否具備誘導Treg的功能，分離和純化小鼠外周血嗜酸性粒細胞，采用流式鑒定細胞表型，結(jié)果顯示，腸道嗜酸性粒細胞與外周血嗜酸性粒細胞表型有差異，腸道嗜酸性粒細胞表達CD80和CD11c，而外周血嗜酸性粒細胞不表達。同時，外周血來源的嗜酸性粒細胞不能分泌維甲酸。