銅綠假單胞菌中RND外排泵基因表達(dá)調(diào)節(jié)和功能研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),原稱綠膿桿菌,是一種革蘭氏陰性菌,在自然界分布廣泛,水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有此菌存在。同時(shí),銅綠假單胞菌也是一類條件致病菌,是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一?；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者,以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染此菌,經(jīng)常引起肺炎、術(shù)后傷口和燒傷面感染,也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。銅綠假單胞菌引起的感染可導(dǎo)致菌血癥和敗血癥的發(fā)生。燒傷后感

2、染銅綠假單胞菌可能會(huì)造成患者死亡。由于銅綠假單胞菌的內(nèi)在性和獲得性多重耐藥性,導(dǎo)致對(duì)其的治療變得很困難。銅綠假單胞菌的內(nèi)在多重耐藥性,是外膜低通透性和大量外排系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。目前,在銅綠假單胞菌中已發(fā)現(xiàn)了5類外排系統(tǒng)家族。其中,RND(resistance-nodulation-celldivision)外排泵系統(tǒng)是這些外排系統(tǒng)家族中重要的一員,與抗生素外排直接相關(guān)；幾乎所有此類外排泵家族成員都與細(xì)菌耐藥性相關(guān),是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主

3、要因?yàn)橹?。因?研究銅綠假單胞菌中RND外排泵,揭示細(xì)菌耐藥機(jī)理,篩選外排泵抑制子,對(duì)了解和控制銅綠假單胞菌耐藥性具有重要意義。雖然現(xiàn)在對(duì)銅綠假單胞菌RND外排泵的研究已經(jīng)有很多,但是,一些重要的基本問(wèn)題還沒(méi)有解決。
　　 本研究以銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員為研究對(duì)象,構(gòu)建了12個(gè)RND外排泵單突變體；同時(shí)結(jié)合以無(wú)啟動(dòng)子的熒光素酶基因操縱子luxCDABE為報(bào)道基因,構(gòu)建了檢測(cè)12個(gè)RND外排泵表達(dá)的報(bào)道子,對(duì)銅綠假單

4、胞菌中RND外排泵家族進(jìn)行研究。主要針對(duì)銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員的表達(dá)水平比較；鋅離子(Zn2+)對(duì)外排泵基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)；外排泵家族成員外排抗菌制劑時(shí)的主次地位進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括:
　　 第一部分,對(duì)銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員的表達(dá)譜、鋅離子對(duì)其表達(dá)的誘導(dǎo)、RND外排泵在抗生素耐藥性中的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果顯示:除了已報(bào)道的四個(gè)RND外排泵mexAB-oprM,mexPQ,m

5、exVW,mexXY,在銅綠假單胞菌中mexJK和muxABC.opmB也屬于組成型表達(dá)；RND外排泵中mexAB-oprM,mexJK,mexXY和czcCBA的啟動(dòng)子表達(dá)受到硫酸鋅的明顯誘導(dǎo).而且czcCBA受誘導(dǎo)程度最顯著。
　　 通過(guò)抗生素耐藥性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):MexAB-OprM突變體對(duì)多種抗生素的抗性下降:而MexGHI-OpmD和MuxhsC-OpmB突變體表現(xiàn)出抗生素抗性升高；同時(shí),除了CzcCBA突變體,MexGHI

6、-OpmO和MexXY-OprM突變體對(duì)鋅離子抗性下降。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CzcCBA的單突變體,PAO(△czcC)在有硫酸鋅存在下,表現(xiàn)出對(duì)多種抗生素敏感性增大,揭示金屬離子對(duì)抗生素抗性的影響。這些結(jié)果表明:在RND外排泵中,MexAB-OprM是外排泵家族中發(fā)揮主要作用的外排泵家族成員,對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星、土霉素、四環(huán)素和鏈霉素的外排起到第一級(jí)的作用；MexAB-OprM和MexEF-OprN在外排泵家族中,對(duì)氨芐青霉素的外排起

7、到第一級(jí)的作用；CzcCBA,MexGHI-OpmD和MexXY-OprM在外排泵家族中,對(duì)鋅離子的外排起到第一級(jí)的作用；鋅離子在銅綠假單胞菌的抗生素抗性中也發(fā)揮著重要的作用；
　　 第二部分,對(duì)當(dāng)時(shí)功能未知的RND外排泵家族成員MuxhsC-Opm8的抗性和致病性等特點(diǎn)進(jìn)行深入的研究。這一RND泵功能在2009年已有報(bào)道,但本研究通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)和致病力實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn),這個(gè)外排泵的單突變可以導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)抗生素氨芐青霉素和羧芐青

8、霉素抗性升高,并造成致病力下降。證明MuxhsC-Opm8不僅與銅綠假單胞菌的抗生素抗性相關(guān),也和細(xì)菌的致病性相關(guān)；而致病力的下降至少部分因?yàn)槭怯捎谕蛔凅w蹭行運(yùn)動(dòng)能力喪失造成的；
　　 第三部分,本研究以czcCBA表達(dá)水平受鋅嚴(yán)格調(diào)控特為依據(jù),構(gòu)建了一組在假單胞菌屬細(xì)菌中可控的表達(dá)系統(tǒng)-pLY系統(tǒng)。通過(guò)連入lux報(bào)道基因和sacB基因,對(duì)這套表達(dá)系統(tǒng)的可控性進(jìn)行了驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)只能在假單胞菌屬細(xì)菌中作

9、用,鋅離子的濃度能夠控制連入基因的表達(dá)強(qiáng)度,且其在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)為對(duì)鋅離子濃度梯度依賴；
　　 第四部分,利用同源性比較,在銅綠假單胞菌中找到了6個(gè)金屬離子外排泵(CzcD1、CzcD2、ZntA1、ZntA2、YvgX和YiiP),并構(gòu)建了它們的報(bào)道子和突變體；以此為基礎(chǔ),檢測(cè)了抗生素和金屬離子對(duì)它們表達(dá)水平的影響,以及它們是否具有對(duì)抗生素和金屬離子的雙重外排功能。結(jié)果表明,雖然不同抗生素對(duì)這六個(gè)金屬離子外排泵的表達(dá)有不同程度

10、的影響,但沒(méi)有檢測(cè)到明顯的金屬離子和抗生素的協(xié)同誘導(dǎo)作用:藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:ZntA1參與到鎘和鋅的外排,ZntA2與鎘的抗性有關(guān)；CzcD2突變體表現(xiàn)出鉆的敏感性升高。但是,這些單突變體的抗生素敏感性變化不明顯。
　　 綜上所述,本研究對(duì)銅綠假單胞菌中RND外排泵家族所有成員的基因表達(dá)調(diào)節(jié)、功能特點(diǎn)、外排泵家族成員外排抗菌制劑中的主次地位,以及金屬離子對(duì)銅綠假單胞菌的抗性影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對(duì)銅綠假單胞菌的耐藥性、致病力