Fas siRNA真核表達載體構建及抑制凋亡作用的實驗研究.pdf

1、目的：構建Fas（CD95）特異性的siRNA真核表達載體psilencircle-FasSi，轉染Fas-FasL凋亡途徑敏感性細胞株Jurkat，進而研究運用RNAi技術下調Fas的抗凋亡作用。 方法：根據(jù)siRNA的設計原則，運用生物信息學設計siRNA靶點，以PCR制備siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)，轉染Jurkat細胞，實時定量熒光PCR檢測Fas的抑制率，篩選出抑

2、制Fas效率較高的siRNA靶點；將上述篩選出的siRNA序列插入siRNA真核表達質粒psilencircle中，構建psilencircle-FasSi。Psilecircle-FasSi轉染Jurkat細胞，實時定量熒光PCR檢測Fas的mRNA、Western blot檢測Fas蛋白的抑制率；anti-Fas mAb刺激Jurkat細胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標記，流式細胞術檢測細胞凋亡率。 結果

3、：構建的psilecircle-FasSi StuⅠ酶切電泳，可見4800bp左右的條帶，測序結果與設計序列一致，表明psilecircle-FasSi真核表達載體構建成功。Psilecircle-Fas Si轉染Jurkat細胞表達后，實時定量熒光PCR檢測Fas mRNA、Western blot檢測Fas蛋白，與未轉染組相比明顯抑制了Fas基因的表達；anti-Fas mAb刺激Jurkat細胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/