海島棉水楊酸途徑基因GbNDR1的克隆及抗黃萎病功能研究.pdf

1、黃萎病嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，種植抗病品種是最為經(jīng)濟有效的防治途徑。栽培陸地棉和海島棉具有不同的優(yōu)良特性，陸地棉產(chǎn)量高、適應(yīng)性強但缺乏免疫或高抗黃萎病材料;海島棉對黃萎病高抗且纖維品質(zhì)優(yōu)良。將海島棉黃萎病抗性轉(zhuǎn)育到陸地棉是現(xiàn)代棉花抗病育種的重要策略之一，抗黃萎病功能基因的挖掘及抗病分子機制研究對于棉花育種改良具有重要意義。
　　本研究以課題組前期構(gòu)建的黃萎病菌誘導下的海島棉cDNA文庫為基礎(chǔ)，篩選并克隆GbNDR1，研究黃萎病菌

2、及水楊酸誘導條件下基因的表達規(guī)律，明確NDR1基因功能，并探索基因抗病作用機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.克隆獲得海島棉GbNDR1基因。該基因序列全長為756bp，其中包含627bp開放閱讀框，無內(nèi)含子，GbNDR1編碼208個氨基酸，相對分子質(zhì)量為22.6kD;NDR1蛋白包含一個跨膜域，屬于脂溶性蛋白，且有一個信號肽;與哺乳動物的LEA14蛋白具有相似的三級結(jié)構(gòu)。棉花NDR1基因高度保守，陸地棉中含有GbNDR1的兩個同源

3、基因Gh_D13G1490和Gh_A13G1195，經(jīng)序列比對，與GbNDR1的序列相似度分別為99.68％和98.41％。GbNDR1基因與毛白楊NDR1基因具有較高的同源性(55.5％)。
　　2.黃萎病菌誘導下，Pima90-53根部組織中GbNDR1的表達量會顯著升高。這表明GbNDR1可受黃萎病菌誘導表達，參與棉花的抗黃萎病反應(yīng)。棉花葉片外源噴施水楊酸后，GbNDR1基因的表達量顯著升高，說明水楊酸也可以誘導GbNDR1

4、基因的表達。
　　3.利用VIGS技術(shù)有效沉默棉花內(nèi)源NDR1基因的表達。沉默植株(TRV∷NDR1)和對照植株(TRV∷00)黃萎病抗性鑒定顯示，TRV∷NDR1植株開始發(fā)病時間較對照植株提前，TRV∷NDR1植株病情指數(shù)(56.9)顯著高于對照植株(32.2)，表明抑制NDR1基因表達會降低棉花的抗病性。生化物質(zhì)測定表明，抑制NDR1基因表達，植株根部和葉片中水楊酸含量均會顯著降低且根部較葉片SA含量變化較早;植株H2O2含量

5、升高，TRV∷NDR1葉片溶液的電導率顯著高于對照植株。
　　4.構(gòu)建了亞細胞定位載體pCamE-GbNDR1，利用農(nóng)桿菌侵染瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片。結(jié)果表明，在細胞質(zhì)膜有明顯的綠色熒光信號，說明GbNDR1在細胞質(zhì)膜表達。
　　5.構(gòu)建了真核表達載體PBI121-GbNDR1，轉(zhuǎn)化擬南芥;并基于卡那霉素篩選和PCR檢測獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
　　綜上，克隆獲得GbNDR1基因，其可受黃萎病菌和水楊酸誘導表達。該基因通過