雌激素反應(yīng)性指蛋白Efp對(duì)Polo樣激酶3作用的研究.pdf

1、目的:
　　對(duì)于雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽(yáng)性的乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療是其最有效的綜合治療方案之一。然而，目前臨床上大約40％的ER陽(yáng)性乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)性耐藥，這為乳腺癌治療構(gòu)成嚴(yán)重阻礙。雌激素反應(yīng)性指蛋白（Estrogen-responsive finger protein，Efp）是ER信號(hào)通路的重要下游靶蛋白之一。作為一種E3泛素連接酶，其結(jié)構(gòu)域中的B-box與卷曲螺旋可特異

2、性地干擾細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子14-3-3σ，通過(guò)泛素蛋白酶體途徑介導(dǎo)14-3-3σ降解，這一途徑是導(dǎo)致ER陽(yáng)性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療耐藥的原因之一。最近研究顯示，在乳腺癌組織中，Polo樣激酶3(Plk3)的表達(dá)與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且Plk3可抑制ER+乳腺癌細(xì)胞的增殖，而前者可被DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)激活，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯為受損DNA提供修復(fù)時(shí)間來(lái)抑制原癌基因發(fā)生轉(zhuǎn)變，降低缺陷基因的積累，是一種潛在的抑癌基因。另外，Plk3在細(xì)胞內(nèi)很容易

3、被降解且可以被蛋白酶抑制劑MG132穩(wěn)定，據(jù)此推測(cè)，Plk3在乳腺癌細(xì)胞中的低表達(dá)有可能也是由Efp通過(guò)泛素途徑降解引起。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題，旨在研究ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞與乳腺癌組織中Efp與Plk3的表達(dá)情況及其之間的相互關(guān)系，以期為Efp在雌激素依賴(lài)型乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制中的作用提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)54例乳腺癌患者乳腺癌組織中Efp與Plk3mRNA的表

4、達(dá)狀況，以及其與相關(guān)臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系。
　　2應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR方法研究Efp mRNA及Plk3 mRNA在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)狀況。
　　3利用基因轉(zhuǎn)染、原位移植方法構(gòu)建裸乳腺癌鼠荷瘤模型，測(cè)量生長(zhǎng)中的瘤體變化，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠后稱(chēng)量瘤體重量，并分析轉(zhuǎn)染Efp與Plk3基因處理對(duì)腫瘤發(fā)展的影響。
　　4通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠移植瘤組織中Efp與Plk3蛋白的表達(dá)狀況，并分析

5、兩者表達(dá)之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　154例乳腺癌患者乳腺癌組織中Efp與Plk3 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量分析結(jié)果顯示，Efp與Plk3基因表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.554，P＜0.01）。Efp、Plk3mRNA表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、絕經(jīng)狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分期和病理類(lèi)型無(wú)明顯關(guān)系。Efp與K-i67蛋白表達(dá)狀態(tài)有關(guān)(P=0.043); Plk3與ER蛋白表達(dá)有關(guān)(P=0.012)，且具有正相關(guān)性(r=0.30

6、7，p=0.025)。
　　2 RT-PCR分析結(jié)果顯示，于MCF-7細(xì)胞系單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp質(zhì)粒后，Plk3mRNA表達(dá)水平明顯低于Efp未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01);與單獨(dú)轉(zhuǎn)染Plk3組相比，共轉(zhuǎn)Efp和Plk3質(zhì)粒組細(xì)胞Plk3mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。
　　3成功建立ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞MCF-7移植瘤裸鼠荷瘤模型。腫瘤瘤體積測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒瘤細(xì)胞對(duì)照處理組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp基因處理組、共同轉(zhuǎn)

7、染Efp和Plk3基因處理組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染Plk3基因處理組小鼠的瘤體生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯差異（F=0.009，P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)量該四組荷瘤小鼠瘤體重量分別為:轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒瘤細(xì)胞對(duì)照處理組小鼠為1.88±0.15g，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp基因處理組小鼠為2.13±0.19g，共同轉(zhuǎn)染Efp和Plk3基因處理組小鼠為1.96±0.23g，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Plk3基因處理組小鼠為1.87±0.12g。單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp基因處理組小鼠瘤體重量與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

8、對(duì)照組相比明顯增加(P=0.049)，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp基因處理組小鼠瘤體重量與單獨(dú)轉(zhuǎn)染Plk3基因處理組小鼠相比明顯增加(P=0.033)。
　　4免疫組織化檢測(cè)結(jié)果顯示，Plk3蛋白在空載體基因轉(zhuǎn)染對(duì)照處理組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染Efp基因處理組、共同轉(zhuǎn)染Efp和Plk3基因處理組，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Plk3基因處理組小鼠腫瘤組織中的表達(dá)積分光密度值(integrated opticaldensity, IOD)分別是:8.26±1.15、2.48±0