巨噬細胞和苯妥英鈉中介的旁分泌機制在心肌梗死后組織修復中的作用.pdf

1、心肌梗死后組織修復過程是影響心室重塑發(fā)展方向的決定因素。近年來的研究顯示，苯妥英鈉(PHT)可以通過介導旁分泌機制加速創(chuàng)傷修復，我們實驗室的前期工作證實苯妥英鈉可加速心肌梗死后組織修復，其可能機制是通過激活巨噬細胞，中介旁分泌機制。巨噬細胞在組織修復中是各種細胞因子和生長因子的重要來源。心肌梗死后早期移植巨噬細胞可促進血管新生、組織修復，改善心室重塑和心臟功能。然而苯妥英鈉通過激活巨噬細胞促進心肌梗死后組織修復的具體機制尚不十分清楚。

2、 目的：本實驗建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，并在梗死后早期進行同種異體腹腔巨噬細胞心肌內(nèi)移植，和PHT預刺激的腹腔巨噬細胞心肌內(nèi)移植，以及梗死后14天持續(xù)給予PHT腹腔內(nèi)注射，觀察上述干預因素對組織病理學、分子生物學和血流動力學的綜合影響，旨在探討巨噬細胞和PHT介導的旁分泌機制對心肌梗死后組織修復和心室重塑過程的影響并探討其可能機制。 方法：1．細胞實驗部分：進行Wistar大鼠腹腔巨噬細胞原代培養(yǎng)，并以苯妥英

3、鈉對部分體外培養(yǎng)的巨噬細胞進行預刺激(24h)，移植前用熒光染料DAPI標記。 2．動物實驗部分：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，成活動物隨機分為假手術組(Sham組，12只)，對照組 (AMI組，23只)，苯妥英鈉組(PHT組，17只)，單純巨噬細胞移植組(Mφ組，20只)，以及經(jīng)苯妥英鈉預刺激的巨噬細胞移植組(Mφ-PHT組，16只)。Mφ組和Mφ-PHT組在再灌注同時，向左心室缺血區(qū)中心及周邊分別以1×10<'5>

4、細胞/只，100μL的劑量多點注射；AMI組和PHT組注射不完全DMEM培養(yǎng)基(100μL)；PHT組從術后第1天開始，連續(xù)14天經(jīng)腹腔注射PHT(75mg/kg/天)。術后第7天，各組分別隨機處死部分動物，留取心臟標本，稱量雙側心室重量；通過苦味酸-天狼猩紅染色測定膠原容積分數(shù)(CVF)及膨展指數(shù)、梗死面積等，結合環(huán)形偏振光分析梗死區(qū)膠原成分比例；抗α-SMA免疫熒光染色測定梗死區(qū)小動脈密度；抗vWF免疫熒光染色測定梗死區(qū)毛細血管密度

5、；抗WGA免疫熒光染色測定非梗死區(qū)心肌細胞橫截面積(CSA)；梗死區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2) 蛋白表達水平采用Western blot分析。剩余動物于模型建立后第28天進行有創(chuàng)血流動力學分析，而后處死動物取心臟組織，進行組織病理學分析。 結果：1．細胞實驗部分：1)體外培養(yǎng)

6、的巨噬細胞貼壁牛長，培養(yǎng)的細胞群中無分裂相；苯妥英鈉刺激后的巨噬細胞仍貼壁良好，生長狀況穩(wěn)定；2)貼壁培養(yǎng)的細胞群中絕大多數(shù)細胞呈CD68 陽性。3) DAPI 標記的巨噬細胞，經(jīng)紫外光激發(fā)后呈現(xiàn)大量圓形或不規(guī)則型的藍色熒光。 2．動物實驗部分：1)巨噬細胞移植成功的證據(jù)：術后1天心肌梗死區(qū)組織CD68免疫熒光染色顯示DAPI標記的巨噬細胞表達CD68。2)術后第28天血流動力學結果：Mφ-PHT 組術后第 28 天LV+dp/

7、dt<,max>顯著高于AMI組；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術后第28天LV+dp/dt<,max>亦增高且具有統(tǒng)計學差異。3)心臟重量指標比較：全心室體重比(V/BW)、左室體重比(LV/BW)、右室體重比(RV/BW)在各組間比較無顯著差異。4)左室重塑指標結果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和 Mφ-PHT 組術后第7天和第28天膨展指數(shù)均顯著減少且具有統(tǒng)計學差異；與AMI組比較，Mφ-PHT組術后第28天梗死面積顯著減?。慌c

8、AMI組比較，PHT組術后7天和第28天梗死面積有減小趨勢；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術后7天和第28天梗死面積有減小趨勢；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT 組術后7 天纖維面積顯著減??；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT 組術后第28天纖維面積顯著減小；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術后第28天纖維面積顯著減??；與AMI組比較，Mφ組和 Mφ-PHT 組術后7天非梗死區(qū)CSA顯著減小，而PHT組術后7天非梗死區(qū)CS

9、A 有減小趨勢；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術后第28天非梗死區(qū)CSA顯著減小。5) 膠原容積分數(shù)結果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組利Mφ-PHT組術后第7天和第28天梗死區(qū)CVF顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術后第7天梗死區(qū)CVF顯著增加；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT組術后第7天和第28天非梗死區(qū)CVF顯著減少。6)膠原成分比例結果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術后第7天和第

10、28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術后第7天和第28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加。7)小動脈密度分析結果：與AMI組比較，PHT 組、Mφ組和Mφ-PHT 組術后第7天和第28天小動脈密度顯著增加：與Mφ組比較，Mφ-PHT組術后第7天和第28天小動脈密度有增加趨勢。8)毛細血管密度分析結果：與AMI 組比較，PHT組術后第7天和第28天毛細血管密度有增加趨勢；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術后第7天和第28天毛

11、細血管密度有增加趨勢。9)Westernblot 檢測結果：與AMI 組比較，Mφ-PHT 組術后第7天梗死區(qū) b-FGF、MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2 蛋白表達水平顯著增強；與AMI組比較，PHT組和Mφ組術后第7天梗死區(qū)MMP-2蛋白表達水平顯著降低；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術后第7天梗死區(qū) VEGF、b-FGF、MMP-2、TIMP-1和TlMP-2蛋白表達水平顯著增強：與Sham組比較，AMI組術后第7天梗死區(qū)M

12、MP-2/TIMP-2比值顯著增加。 結論：1．苯妥英鈉可能通過介導旁分泌機制，加速膠原沉積和成熟，并促進小動脈形成，加速組織修復過程，繼而改善心肌梗死后心室重塑；2．心肌梗死區(qū)巨噬細胞移植亦可通過上述機制加速組織修復、改善心肌梗死后心室重塑；3．苯妥英鈉預刺激的巨噬絀胞可以對心肌梗死后組織修復過程產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，可能機制為通過旁分泌效應上調(diào)多種與組織修復密切相關的生長因子/關鍵酶系的蛋白表達水平，加速組織修復過程，且改善左