細(xì)絲蛋白A調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體活性在乳腺癌發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的第一位惡性腫瘤。
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）家族包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER2/neu、erbB-3和erbB-4四大成員，屬于Ⅰ型酪氨酸激酶受體，酪氨酸磷酸化可使受體活化，控制著細(xì)胞的增殖、分化、移動(dòng)和存活，受體的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。
　　 細(xì)絲蛋白A（FilaminA，F(xiàn)LNa），是細(xì)胞內(nèi)一種

2、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，同時(shí)又是腳手架蛋白，在細(xì)胞漿內(nèi)廣泛分布，也可以跨膜分布或轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。
　　 許多研究證實(shí)FLNa在惡性腫瘤細(xì)胞的表達(dá)增多。如肺癌細(xì)胞內(nèi)FLNa的表達(dá)上調(diào)，與肺癌的遷徙、粘附和侵襲相關(guān)；前列腺癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)FLNa表達(dá)較正常前列腺組織顯著增高，且有轉(zhuǎn)移的前列腺癌FLNa的表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移者；乳腺癌細(xì)胞內(nèi)也存在FLNa高表達(dá)。
　　 為此，我們擬利用人乳腺癌細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)染FLNa的siRNA降低FLNa表

3、達(dá)、轉(zhuǎn)染FLNa全長(zhǎng)基因增加FLNa的表達(dá)后，觀察EGFR的磷酸化水平及與EGFR磷酸化的相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的變化；經(jīng)免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation，IP）證實(shí)FLNa與EGFR分子間的相互關(guān)系；利用MTT檢測(cè)FLNa的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。從組織、細(xì)胞和分子水平綜合分析FLNa對(duì)EGFR磷酸化的調(diào)控，探討FLNa調(diào)控EGFR磷酸化在乳腺癌發(fā)病中的作用，為有效治療乳腺癌提供新靶點(diǎn)。
　　 第一部分

4、細(xì)絲蛋白A在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性方法：采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）免疫組織化學(xué)方法和流式細(xì)胞分析技術(shù)，檢測(cè)46例分化程度不同的浸潤性乳腺癌細(xì)胞中FLNa和增殖細(xì)胞核抗原（pro-liferatingcellnuclearantigen，PCNA）的表達(dá)情況，以正常乳腺組織或乳腺良性增生為陰性對(duì)照。
　　 1.FLNa在乳腺癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果：FLNa在正常乳腺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)少量表

5、達(dá)（Fig.1-1）；FLNa在浸潤性乳腺癌細(xì)胞陽性表達(dá)的程度較強(qiáng)，且隨組織分化程度的降低而增高（Fig.1-2～4、Fable1-1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的FLNa的表達(dá)明顯強(qiáng)于無轉(zhuǎn)移組（Table1-1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。FLNa在浸潤性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與組織學(xué)分型無關(guān)。
　　 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果：FLNa在正常乳腺組織的表達(dá)量較少；在低分化乳腺癌細(xì)胞中FLNa的表達(dá)（

6、1.22±0.13）明顯高于中高分化的乳腺癌細(xì)胞（1.10±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見Fig.1-6、Table1-2。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（1.21±0.11）明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（1.10±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見Table1-2。FLNa在浸潤性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與組織學(xué)分型無關(guān)。
　　 2.PCNA在乳腺癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果：PCNA在浸潤性乳腺癌細(xì)胞核呈陽性表達(dá)，PCNA

7、的表達(dá)隨乳腺癌分化程度的降低而增強(qiáng)，在低分化浸潤性乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，見Figl.1-5。
　　 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果：低分化浸潤性乳腺癌細(xì)胞中PCNA的表達(dá)（1.65±0.22）明顯高于中高分化乳腺癌（1.35±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞PCNA的表達(dá)（1.42±0.15）明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（1.56±0.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見Fig.1-7、Table1

8、-3。PCNA的表達(dá)與FLNa呈正相關(guān)（P<0.05）。
　　 第二部分FLNa對(duì)乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體活化的影響方法：
　　 1.沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR活化的影響用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。
　　 2.FLNa過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR活化的影響細(xì)胞培養(yǎng)
　　 3.免疫共沉淀證實(shí)FLNa對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR的活化影響細(xì)胞培養(yǎng)
　　 結(jié)果

9、：
　　 1.沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR活化的影響1.1FLNa蛋白的表達(dá)：FLNa-siRNA轉(zhuǎn)染組FLNa的表達(dá)（1.40±0.10、1.27±0.06）較HK對(duì)照組（3.97±0.29、3.33±0.06）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見Fig.2-1、Table2-1。
　　 1.2EGFR蛋白磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，F(xiàn)LNa-siRNA轉(zhuǎn)染組的EGFR磷酸化水平

10、（0.73±0.01、0.37±0.05）明顯低于HK對(duì)照組（1.08±0.01、1.30±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見Fig.2-2、Table2-2。
　　 1.3ERK磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，F(xiàn)LNa的siRNA轉(zhuǎn)染組ERK磷酸化水平（0.17±0.00、0.12±40.04）明顯低于HK對(duì)照組（0.32±0.02、0.54±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見Fi

11、g.2-3、Table2-3。
　　 2.FLNa過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR活化的影響2.1FLNa的表達(dá)：FLNa-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FLNa的表達(dá)（5.93±0.38、6.07±0.32）明顯高于空質(zhì)粒pcDNA3.1對(duì)照組組（4.50±0.20、4.60±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見Fig.2-4、Table2-4。
　　 2.2EGFR蛋白磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，F(xiàn)LN

12、a-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組EGFR的磷酸化水平（1.53±0.11、0.86±0.14）明顯高于空質(zhì)粒pcDNA3.1對(duì)照組（0.574±0.01、0.444±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P<0.01，P<0.05），見Fig.2-5、Table2-5。
　　 2.3ERK磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，F(xiàn)LNa-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組ERK的磷酸化水平（1.834±0.07、1.06±0.07）明顯高于空質(zhì)粒pcD

13、NA3.1對(duì)照組（0.744±0.01、0.594±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見Fig.2-6、Table2-6。
　　 3.免疫共沉淀證實(shí)FLNa對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR活化的影響3.1FLNa-siRNA轉(zhuǎn)染后FLNa的表達(dá)：FLNa-siRNA轉(zhuǎn)染組FLNa的表達(dá)（3.53±1.08、4.33±1.33）較HK對(duì)照組（7.234±2.20、7.534±1.86）組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01

14、）。見Fig.2-7、Table2-7。
　　 3.2經(jīng)抗EGFR抗體免疫沉淀后的EGFR磷酸化的水平：EGF刺激10min后，F(xiàn)LNa-siRNA轉(zhuǎn)染組的EGFR磷酸化水平（1.09±0.09）明顯低于HK對(duì)照組（2.32±0.22），差異有顯著性（P<0.01）。見Fig.2-8、Table2-8。
　　 3.3經(jīng)抗酪氨酸磷酸化4G10抗體免疫沉淀后EGFR的表達(dá)：EGF刺激10min時(shí)，F(xiàn)LNa-siRNA轉(zhuǎn)染組的

15、EGFR表達(dá)（0.42±0.01）明顯低于HK對(duì)照組（1.07±0.01），差異有顯著性（P<0.01），見Fig.2-9、Table2-9。
　　 第三部分細(xì)絲蛋白A對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響方法：細(xì)胞培養(yǎng)見第二部分的方法1。用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為9×103/ml，按100μL/孔體積接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)分組：FLNa-siRNA轉(zhuǎn)染組和HK對(duì)照組；FLNa-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒pcDNA3.1對(duì)

16、照組。分別用不同濃度的EGF（4nM、20nM、100nM）刺激過夜，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.FLNa沉默后MDA-MB-231細(xì)胞增殖水平：在4nM、20nM、100nM濃度的EGF刺激下，F(xiàn)LNa-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖水平隨刺激濃度的增加而增高，F(xiàn)LNa沉默后細(xì)胞的增殖水平（1.284±0.09、1.46±0.02、1.58±0.06）均低于對(duì)照組（1.55±0.12、1.62±

17、0.06、1.68±0.12），差異有顯著性（p<0.01），見Fig.3-1、Table3-1。
　　 2.FLNa過表達(dá)后MDA-MB-231的細(xì)胞增殖水平：在4nM、20nM、100nM濃度的EGF刺激下，F(xiàn)LNa-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖水平隨刺激濃度的增加而增高，但FLNa-full質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖水平（1.14±0.08、1.28±0.11、1.51±0.03）高于對(duì)照組（1.09±0.17、1.21±0.1

18、7、1.25±0.05），差異有顯著性（P<0.01），見Fig.3-2、Fable3-2。
　　 結(jié)論：
　　 1.FLNa在正常乳腺組織少量表達(dá)；FLNa的表達(dá)隨浸潤性乳腺癌分化程度的降低而增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；FLNa的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)。
　　 2.FLNa的表達(dá)可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EGFR的磷酸化，磷酸化的EGFR又通過MAPK.增殖信號(hào)傳導(dǎo)通路活化ERK，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖。