刺五加注射液、菌梔黃注射液對(duì)大鼠肝CYP3A的影響.pdf

1、中藥的進(jìn)一步發(fā)展需要進(jìn)行中藥現(xiàn)代化的研究，其中，中藥藥動(dòng)學(xué)是一項(xiàng)重要內(nèi)容。大多數(shù)中藥的體內(nèi)過(guò)程目前還不清楚，在臨床應(yīng)用上也缺乏科學(xué)依據(jù)，中西藥合用的過(guò)程中就很容易產(chǎn)生藥物相互作用。在藥物相互作用的發(fā)生率中，以代謝性相互作用發(fā)生率最高。
　　 細(xì)胞色素P450酶是體內(nèi)藥物代謝的主要酶類，其中以CYP3A亞型的含量以及代謝的藥物最多，為CYP450系統(tǒng)中最重要的一類。CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制是發(fā)生相互作用的重要因?yàn)?。目前有關(guān)中藥對(duì)

2、CYP450的影響研究報(bào)道較少，且多集中在中藥提取物、中藥活性成分對(duì)CYP的影響，而有關(guān)臨床上中藥的主要應(yīng)用方式中藥復(fù)方、中成藥對(duì)CYP的影響的研究較少，因此，研究中成藥、中藥復(fù)方對(duì)CYP450的影響具有很強(qiáng)的實(shí)用意義。
　　 本研究的前期結(jié)果表明，刺五加注射液和茵梔黃注射液對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A有較強(qiáng)的抑制作用，因此本研究對(duì)二者進(jìn)行了更深入的研究。
　　 研究目的:
　　 本研究采用體外實(shí)驗(yàn)研究刺五加注射液和

3、茵梔黃注射液中主要活性成分對(duì)CYP3A的抑制作用，從而闡明二者對(duì)CYP3A的抑制作用，并采用體內(nèi)試驗(yàn)的方法研究刺五加注射液和茵梔黃注射液對(duì)CYP3A的特異性底物咪達(dá)唑侖的藥動(dòng)學(xué)的影響，評(píng)價(jià)二者對(duì)CYP3A的體內(nèi)影響作用，指導(dǎo)其臨床用藥。
　　 研究方法:
　　 1.刺五加注射液對(duì)CYP3A的影響
　　 1.1刺五加注射液中刺五加苷B、刺五加苷E、異秦皮啶的含量測(cè)定HPLC法測(cè)定刺五加注射液中刺五加苷B、刺五加苷E

4、、異秦皮啶的含量。
　　 1.2刺五加注射液及其組分刺五加苷B、刺五加苷E、異秦皮啶對(duì)CYP3A的體外抑制作用
　　 1.2.1大鼠肝微粒體的制備取肝臟采用鈣沉淀法制備大鼠肝微粒體。
　　 1.2.2微粒體蛋白的含量測(cè)定Bradfrod法測(cè)定微粒體蛋白含量。
　　 1.2.3孵育反應(yīng)孵育體系總體積500μL，反應(yīng)體系中包含NADPH，磷酸鹽緩沖液，EDTA，MgCl2和微粒體蛋白。反應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行，

5、預(yù)孵育5min，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組加入各成分，對(duì)照組加入等體積磷酸鹽緩沖液。
　　 1.2.4酶活性的測(cè)定HPLC法測(cè)定咪達(dá)唑侖的轉(zhuǎn)化程度。
　　 1.3刺五加注射液對(duì)大鼠體內(nèi)咪達(dá)唑侖藥動(dòng)學(xué)的影響大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每日靜脈注射刺五加注射液(40ml·kg-1)，對(duì)照組每日靜脈注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)給藥7d，末次給藥2h后，尾靜脈注射咪達(dá)唑侖注射液10mg·kg

6、-1，分別于給藥后2，5，8，11，15，25，35，45，60，90min采血0.5ml，肝素抗凝，離心分離血漿，HPLC法測(cè)定血漿中咪達(dá)唑侖的濃度。
　　 2.茵梔黃注射液對(duì)CYP3A的影響
　　 2.1茵梔黃注射液及其組分黃芩苷、梔子苷對(duì)大鼠CYP3A的體外抑制作用
　　 2.1.1大鼠肝微粒體的制備采用鈣沉淀法制備大鼠肝微粒體。
　　 2.1.2微粒體蛋白的含量測(cè)定Bradfrod法測(cè)定微粒體蛋白

7、含量。
　　 2.1.3孵育反應(yīng)孵育體系總體積500μL，反應(yīng)體系中包含NADPH，磷酸鹽緩沖液，EDTA，MgCl2和微粒體蛋白。反應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行，預(yù)孵育5min，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組加入各成分，對(duì)照組加入等體積磷酸鹽緩沖液。
　　 2.1.4酶活性的測(cè)定HPLC法測(cè)定咪達(dá)唑侖的轉(zhuǎn)化程度。
　　 2.2茵梔黃注射液連續(xù)給藥對(duì)大鼠CYP3A的抑制作用大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和

8、對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每日靜脈注射茵梔黃注射液(40mg·kg-1)，對(duì)照組每日靜脈注射相同劑量的葡萄糖注射液，連續(xù)給藥7d，末次給藥后即刻處死大鼠取肝臟制備肝微粒體，體外測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠咪達(dá)唑侖的轉(zhuǎn)化程度。
　　 2.3茵梔黃注射液對(duì)大鼠體內(nèi)咪達(dá)唑侖藥動(dòng)學(xué)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照，12只雄性SD大鼠連續(xù)尾靜脈注射10％葡萄糖注射液3d后，于末次給藥后即刻，單次快速靜脈注射咪達(dá)唑侖注射液10mg·kg-1，并于2，7

9、，15，30，50，70，100min采血0.5ml，離心分離血漿。
　　 首次采血3d后，12只大鼠尾靜脈注射茵梔黃注射液(40mg·kg-1)，連續(xù)給藥7d，末次給藥后靜脈注射咪達(dá)唑侖注射液10mg·kg-1，分別在給藥后上述時(shí)間點(diǎn)采血0.5ml，離心分離血漿。
　　 HPLC法測(cè)定大鼠單用咪達(dá)唑侖注射液組與合用茵梔黃注射液組咪達(dá)唑侖的血藥濃度。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件，計(jì)算咪達(dá)唑侖藥動(dòng)學(xué)參

10、數(shù)。應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，咪達(dá)唑侖單用組及與茵梔黃注射液合用組咪達(dá)唑侖血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.刺五加注射液對(duì)CYP3A的影響
　　 1.1刺五加注射液中刺五加苷B、刺五加苷E、異秦皮啶的含量測(cè)定
　　 兩批次刺五加注射液中刺五加苷B、刺五加苷E和異秦皮啶的含量分別為：0.19

11、2、0.108、0.0165mg·ml-1(080915);0.228、0.138、0.0266mg·ml-1(081011)。
　　 1.2體外實(shí)驗(yàn)研究刺五加注射液中刺五加苷B、刺五加苷E、異秦皮啶對(duì)CYP3A的抑制作用刺五加注射液對(duì)CYP3A有抑制作用(P<0.001)，抑制率為33.78±1.57％；刺五加苷B(P=0.159)、刺五加苷E(P=0.290)、異秦皮啶(P=-0.317)和三成分合用組(P=0.134)對(duì)大

12、鼠CYP3A無(wú)顯著抑制作用。
　　 1.3刺五加注射液對(duì)咪達(dá)唑侖的藥動(dòng)學(xué)的影響咪達(dá)唑侖靜脈注射后，在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)符合二室模型。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組咪達(dá)唑侖血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著性差異。
　　 2.茵梔黃注射液對(duì)CYP3A的影響
　　 2.1茵梔黃注射液及其組分黃芩苷、梔子苷對(duì)大鼠CYP3A的體外抑制作用茵梔黃注射液(P=0.002)、黃芩苷(P=0.01)、黃芩苷和梔子苷合用組(P=0.001)對(duì)CYP3

13、A有抑制作用，抑制率分別為(48.49±4.51)％、(57.41±10.08)％、(43.68±7.50)％；梔子苷(P=0.259)對(duì)CYP3A無(wú)顯著抑制作用。
　　 2.2茵梔黃注射液連續(xù)給藥對(duì)大鼠CYP3A的抑制作用連續(xù)靜脈注射茵梔黃注射液7d后，實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP3A酶活性顯著低于對(duì)照組(P=0.002)，探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖的代謝減少了約(39.64±15.87)％。
　　 2.3茵梔黃注射液對(duì)大鼠體內(nèi)咪達(dá)唑侖藥動(dòng)

14、學(xué)的影響合用茵梔黃注射液后，咪達(dá)唑侖的血藥濃度較單用組有顯著提高，單用組與合用組咪達(dá)唑侖的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0→t值分別為160.28±44.45、357.46±153.02(μg·ml-1)·min，合用組較單用組有顯著提高(P<0.001)；CL值分別為0.059±0.016、0.028±0.012 mg·kg-1·min-1，合用組較單用組有顯著下降(P<0.001)；T1/2β分別為39.58±8.63、38.96±12.14

15、 min，二者相比沒(méi)有顯著變化(P=0.894)。
　　 結(jié)論：
　　 1.刺五加注射液可明顯抑制大鼠離體肝微粒體CYP3A活性，其抑制作用與刺五加苷B、刺五加苷E和異秦皮啶無(wú)關(guān)。
　　 2.刺五加注射液對(duì)CYP3A探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)無(wú)明顯影響。
　　 3.茵梔黃注射液對(duì)大鼠離體肝CYP3A有明顯抑制作用，其作用與黃芩苷有關(guān)。
　　 4.茵梔黃注射液多次給藥對(duì)大鼠肝CYP3A有明顯