家蠶二分濃核病毒結構蛋白P133基因的啟動子活性分析.pdf

1、家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）歸屬于新設定的二分DNA病毒科，是一類小的動物二分DNA病毒。該病毒與家蠶濃核病毒Ⅰ型相似，病毒粒子為二十面體非囊膜包裹結構，主要感染家蠶的中腸柱狀上皮細胞，并引發(fā)家蠶濃核癥。感染的幼蟲主要表現(xiàn)為厭食、空頭和下痢等癥狀。而且在感染晚期幼蟲的中腸后部顏色變?yōu)榈S色，蠶沙成串珠狀。BmBDV基因組包括兩個節(jié)段的單鏈DNA分子6.6kb(VD1)和6.0kb(VD

2、2)，獨立包裝于衣殼中。VD2含有兩個ORF，分別編碼非結構蛋白NS3及次要結構蛋白P133，目前針對VD2啟動子活性及其基因表達調控的相關研究還未見報道，而這些工作對于全面了解BmBDV基因表達調控有著重要的意義。
　　P133基因5'端非編碼區(qū)UTR長度為666nt，包括524nt的基因組末端重復序列(ITR)。生物信息學分析表明，假定的轉錄起始基序Inr(TAGT)和TATA-box分別位于P133蛋白基因起始密碼子上游-8

3、nt和-33nt。在ITR區(qū)域內還存在其他啟動子特征性序列CAAT-box、GC-box等。根據(jù)TATA-box及編碼P133的ORF的位置，p133基因的啟動子位于VD2遺傳圖距單位89位置，因此將調控p133基因表達的啟動子稱為P89。
　　為了分析P89的啟動活性，我們克隆了p133基因5'端非編碼區(qū)666bp的序列。將啟動子序列插入到pGL3-Basic構建啟動子報告質粒，并利用雙螢光素酶報告系統(tǒng)分析其啟動子活性。結果顯示

4、，P89能在昆蟲細胞Sf9、BmE、BmN和Hi5中啟動螢光素酶的表達，在Hi5細胞中P89活性高于在其他幾種細胞系中的活性。參考生物信息學分析結果，構建了一系列含不同截短片段的重組質粒，并通過螢光素酶活性檢測來分析活性。熒光分析的結果表明，TATA-box是維持P89基礎活性的必須元件;TATA-box上游存在一個沉默子元件，缺失起始密碼子上游-268nt～-195nt區(qū)域，P89活性提高至基礎活性的7.15倍;然而，繼續(xù)缺失至-14

5、3nt，P89活性又恢復到基礎活性，說明-195nt至-143nt區(qū)域賦予P89較高的啟動子活性。為了查明BmBDV編碼的非結構蛋白是否調控P89的活性，構建了非結構蛋白NS1、NS2以及NS3的瞬時表達質粒，與pGL3-P89以及內參海參熒光素酶表達質粒共轉染。蛋白的表達通過Western blotting確定。結果表明NS1和NS2可以反式激活啟動子，分別使P89活性提高了15.5％和69.9％。本研究還比較分析了BmBDV所有基因