創(chuàng)傷弧菌消殺抗性及其菌體抗原、溶細胞毒素蛋白抗原主動免疫的動物實驗研究.pdf

1、研究背景和目的: 創(chuàng)傷弧菌（Vbrio vulnificus，Vv）是弧菌屬第5群細菌，根據(jù)其生化特性、流行病學模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個亞型，其中Ⅰ型Vv是導致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。目前世界上大部分沿海國家都有創(chuàng)傷弧菌感染的病例報告。我國國內1990年報道首例，隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報道，其病死率一直居高不下。對本病的認識不足，發(fā)病早期未能正確診斷，或

2、誤診為藥物超敏反應而使用大劑量激素，是造成高病死率的主要原因。創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有二：一是經(jīng)口感染，二是通過皮膚傷口侵入。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥，其死亡率高達50%以上。那么，我們能否采取措施避免接觸到創(chuàng)傷弧菌呢？在不可避免接觸到創(chuàng)傷弧菌的情況下，我們能否通過機體主動免疫的方法避免其感染乃至致病呢？為此，我們設計了本課題，試圖通過體外及主動免疫動物實驗來回答上述問題。 方法: 1．創(chuàng)傷弧菌的生化特性及抗性研究：

3、 1．1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌接種于弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后，目測或上機讀取鑒定結果。 1．2紫外線抗性：創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、大腸桿菌ATCC25922懸液及平板在強度值達90μW/c㎡的紫外線照射不同時間后，培養(yǎng)并定量測試照射前后的活菌濃度，統(tǒng)計殺菌率，繪制照射前后滅活曲線（t-△lg）。 1．33種消毒劑抗性：戊二醛、過氧乙酸及乙醇以無菌去離子水1：2等比系列稀釋至1：256后作用于創(chuàng)傷弧菌，培養(yǎng)

4、24h觀察細菌生長情況，確定其對創(chuàng)傷弧菌的最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）；20g/L戊二醛、5g/L過氧乙酸及75%乙醇作用于創(chuàng)傷弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s，培養(yǎng)24h后觀察細菌生長情況，確定其對創(chuàng)傷弧菌的最快殺菌時效。 2．創(chuàng)傷弧菌主動免疫預防的動物實驗研究 2．1創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素的提取、純化及鑒定 重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E． coliBL21（DE3

5、）恢復培養(yǎng)，行藍白斑篩選，挑取白色菌斑進行PCR擴增并瓊脂糖電泳驗證目的基因存在。挑選陽性克隆并以最佳誘導條件進行誘導培養(yǎng)，離心收集細菌，超聲破菌，離心后上清液經(jīng)過His-Bind親和層析方法純化重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素（rVVC）并行SDS-PAGE電泳及Western-blot驗證。純化后的蛋白以透析法進行復性和濃縮。采用BCA（bicinchoninicacid）法進行蛋白定量，繪制標準曲線，計算出蛋白濃度。 2．2創(chuàng)傷弧菌

6、主動免疫預防的動物實驗研究 （1）實驗動物及分組：SPF級BALB/c小鼠54只，雌雄不拘，隨機分為創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組（簡稱菌體抗原組）、溶細胞毒素蛋白抗原組（簡稱蛋白抗原組）、生理鹽水對照組（簡稱對照組）各18只。 （2）抗原制備：創(chuàng)傷弧菌菌體抗原，新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌以0．3%甲醛滅活24h，無菌試驗合格后4℃保存；創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素蛋白抗原，rVVC與完全弗氏佐劑/不完全弗氏佐劑等體積乳化制成。 （3）免疫方

7、案：小鼠皮下多點注射，創(chuàng)傷弧菌菌體抗原組小鼠接種菌體抗原：1×108個/只/次；溶細胞毒素蛋白抗原組小鼠接種蛋白抗原50μg/只/次；生理鹽水對照組小鼠接種生理鹽水：0．2ml/只/次，0d、首次免疫14d后每10d加強一次。 （4）小鼠免疫學指標：免疫接種3-6次后，每組3只小鼠取外周血行流式細胞術檢測小鼠外周血中淋巴細胞亞群比例；每組6只小鼠，取脾及胸腺，稱重，MTT法檢測脾淋巴細胞轉化率；血清凝集試驗及間接ELISA法檢測

8、特異性抗體及IgG效價。 （5）創(chuàng)傷弧菌攻擊試驗：3組小鼠按上述方法免疫接種6次后，12只/組，75%酒精棉球消毒右下腹皮膚后腹腔注射新鮮培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌ATCC27562懸液，0．5ml/只，細菌濃度約為107-108cfu/ml。監(jiān)測所有小鼠一般情況，包括呼吸、精神狀態(tài)、毛發(fā)、體溫等。小鼠死亡后立即解剖，存活小鼠于注射活菌后48h或10d斷椎法處死，取其主要臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色，光鏡下觀察其病理變化

9、。同時取心臟內血液或血凝塊進行Vv分離培養(yǎng)及生化鑒定。 結論: 1．創(chuàng)傷弧菌ATCC27562對紫外線敏感，屬紫外線低度抗性菌；90 uW/c㎡的紫外線能有效滅殺創(chuàng)傷弧菌ATCC27562，20g/L戊二醛、5g/L過氧乙酸、75%乙醇能將其迅速有效滅活。 2．創(chuàng)傷弧菌菌體抗原、創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增強BALB/c小鼠特異性體液免疫功能，產(chǎn)生創(chuàng)傷弧菌菌體抗體及創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素蛋白抗體，使小鼠獲