機械損傷誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞自噬與凋亡之間作用的實驗研究.pdf

1、第一章：脊髓神經(jīng)元細胞自噬的鑒定及機械損傷對細胞自噬和凋亡的影響
　　目的:脊髓神經(jīng)元細胞機械性損傷后自噬的鑒定,觀察機械性損傷對脊髓神經(jīng)元細胞自噬及凋亡的影響。
　　方法:
　　(1)采用闕海萍介紹的方法建立原代脊髓神經(jīng)元細胞機械損傷模型;
　　(2)HE染色以及NSE和DAPI熒光雙標記觀察神經(jīng)元細胞形態(tài);
　　(3)構(gòu)建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重組質(zhì)粒,采用熒光顯微鏡觀察熒光斑點;電鏡

2、觀察細胞超微結(jié)構(gòu),MDC、AO熒光染色,Western Blot檢測Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達對細胞自噬進行鑒定;
　　(4)MTT法觀察機械損傷對細胞活性的影響;
　　(5)流式細胞儀檢測機械損傷對細胞周期和凋亡的影響;
　　(6)Western Blot檢測機械損傷對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)機械損傷處理后可見大部分神經(jīng)元細胞軸突和樹突被切斷,3h后細

3、胞培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量漂浮細胞;
　　(2)HE染色顯示神經(jīng)元細胞軸突和樹突清晰,純度大于90％;
　　(3)NSE和DAPI熒光雙標記可明顯看到NSE綠色熒光和DAPI紅色熒光,神經(jīng)元細胞形態(tài)完整;
　　(4)成功構(gòu)建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至神經(jīng)元細胞中;
　　(5)機械損傷24h后熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色斑點積聚;
　　(6)MDC及AO熒光染色顯示機械損傷

4、24h后神經(jīng)元細胞出現(xiàn)大量自噬空泡;電鏡下觀察到自噬體及凋亡小體形成;
　　(7)機械損傷24h后神經(jīng)元細胞中Beclin-1的表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值都達到高峰;
　　(8)細胞死亡率隨損傷時間的延長逐漸增加,24h后細胞死亡率有所減少;
　　(9)細胞凋亡率隨損傷時間的延長逐漸升高,3h后細胞凋亡率有明顯升高;
　　(10)隨著損傷后時間的增加,Bcl-2蛋白表達水平先增加,3h后逐漸減少,而Bax蛋白表

5、達水平隨損傷時間逐漸增加。
　　結(jié)論:
　　(1)機械損傷會誘發(fā)神經(jīng)元細胞自噬的產(chǎn)生,自噬活性在損傷后24h達到高峰;
　　(2)機械損傷會促使神經(jīng)元細胞凋亡和壞死,降低細胞的存活率;
　　(3)神經(jīng)元細胞在自噬發(fā)生前期可能通過促進Bcl-2的表達或抑制Bax的表達來抑制細胞凋亡;
　　(4)采用損傷24h作為后期藥物處理時間點。
　　第二章：自噬調(diào)控對機械性損傷誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞自噬及凋亡影響

6、r>　　目的:探討自噬調(diào)控對機械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞自噬及凋亡影響。
　　方法:
　　(1)分別采用雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤促進和抑制細胞自噬活性;
　　(2)WesternBlot檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達水平;
　　(3)RT-PCR檢測LC3和Beclin-1的mRNA水平;
　　(4)MTT檢測自噬調(diào)控對細胞活力的影響;
　　(5)流式細胞儀檢測自噬調(diào)控對細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:

7、
　　(1)雷帕霉素明顯增加了神經(jīng)元細胞機械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表達水平,而3-MA在一定程度上降低了神經(jīng)元細胞機械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表達水平;
　　(2)雷帕霉素明顯增加了神經(jīng)元細胞機械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平,而3-MA在一定程度上降低了神經(jīng)元細胞機械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平;

8、
　　(3)雷帕霉素降低了機械損傷后神經(jīng)元細胞的死亡率,而3-MA提高了細胞的死亡率;
　　(4)雷帕霉素降低了機械損傷后神經(jīng)元細胞的凋亡率,而3-MA提高了細胞的凋亡率;
　　(5)雷帕霉素降低了機械損傷后神經(jīng)元細胞Bax的表達,而3-MA增加了Bax的表達;雷帕霉素增加了機械損傷后神經(jīng)元細胞Bcl-2的表達,而3-MA在一定程度上降低了Bcl-2的表達;
　　(6)機械損傷后神經(jīng)元細胞中p-mTOR和p-AK

9、T的表達水平明顯降低,mTOR和AKT的表達水平略有升高;
　　(7)雷帕霉素明顯降低了p-mTOR和p-AKT的表達水平。
　　結(jié)論:
　　(1)雷帕霉素提高了神經(jīng)元細胞的自噬活性,而3-MA在一定程度上抑制了細胞的自噬活性;
　　(2)雷帕霉素在一定程度上可抑制神經(jīng)元細胞凋亡和壞死,而3-MA則促進了細胞凋亡和壞死;
　　(3)雷帕霉素抑制神經(jīng)元細胞凋亡可能是通過增加Bcl-2的表達,降低Bax的表達來

10、實現(xiàn);相反,3-MA促進細胞凋亡可能是通過增加Bax的表達,降低Bcl-2的表達來實現(xiàn);
　　(4)雷帕霉素促進神經(jīng)元細胞自噬可能通過下調(diào)mTOR和AKT磷酸化水平來實現(xiàn)的。
　　第三章：Beclin-1基因在機械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞自噬及凋亡中的作用
　　目的:探討B(tài)eclin-1基因在機械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞自噬及凋亡中的作用。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建過表達Beclin-1重組質(zhì)粒pcDNA-3

11、.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表達重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-miRNA,轉(zhuǎn)染細胞后采用Western Blot驗證;
　　(2)Western Blot檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達水平;
　　(3)MTT檢測過表達和沉默Beclin-1對細胞活力的影響;
　　(4)流式細胞儀檢測過表達和沉默Beclin-1對細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建了過表達Beclin-1

12、重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表達重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-miRNA;
　　(2)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的細胞中Beclin-1表達水平明顯升高,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的細胞中Beclin-1表達水平明顯降低;
　　(3)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞中損傷24h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯

13、增大,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯減小;
　　(4)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞損傷24h后的死亡率有所降低,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞的死亡率有所升高;
　　(5)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞損傷24h后的凋亡率有所降低,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒

14、的神經(jīng)元細胞的凋亡率有所升高;
　　(6)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞損傷24h后Bcl-2表達量增加,Bax的表達量減少;而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細胞損傷24h后Bax表達量增加,Bcl-2的表達量減少。
　　結(jié)論:
　　(1)過表達Beclin-1可能會促進神經(jīng)元自噬,而沉默Beclin-1可能會抑制自噬的發(fā)生;
　　(2)過表達Beclin-1