骨髓間充質(zhì)干細胞修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs），了解其生長特點。確證堿性成纖維生長因子對于MSCs增殖的促進作用，并與MSCs和纖維蛋白凝膠共同移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，觀察其軟骨修復狀況。
　　 方法:選用6-8月齡新西蘭大白兔，從脛骨和腓骨沖洗得骨髓，以淋巴細胞分離液分離的方法獲得骨髓間充質(zhì)干細胞，進行常規(guī)培養(yǎng)，觀察其生長特點。并用不同濃度的bFGF溶液與MSCs共培養(yǎng)，分別在一周內(nèi)不同時間點用MTT法檢測bFGF對于MSCs增

2、殖的促進作用。將MSCs在6孔板中鋪板后，分別加入不同濃度的Brdu溶液和CFDA溶液，并分別在不同的時間點用熒光染色相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，測定標記率。分別將含bFGF的MSCs混懸液和MSCs細胞懸液與纖維蛋白原，凝血酶，氨甲環(huán)酸，CFDA標記物的混懸液混合，制得MSCs纖維蛋白凝膠。以bFGF復合MSCs纖維蛋白凝膠組為A組，單純MSCs纖維蛋白凝膠組為B組，單純兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組為C組，分別在4周，8周，12周用大體

3、觀察，HE染色，甲苯胺藍染色，Masson染色及組織工程學評分的方法觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處軟骨修復的狀況。
　　 結(jié)果:原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞接種后生長迅速，12～14天細胞長成單層，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞形成多層生長。細胞傳代后仍保持成纖維細胞樣外形。P5代后細胞生長速度較P3代細胞略減慢。繪制生長曲線可以見三代細胞生長周期基本一致，均為接種培養(yǎng)后前二三天，生長較緩慢，為生長遲滯期。三天后細胞生長加速，有一快速增長過程，達

4、到對數(shù)生長期，于七八天時，細胞數(shù)達最高值，為生長平臺期，其后生長速度減緩，細胞出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。MTT檢測結(jié)果顯示低濃度bFGF（1.0～10ng/ml）隨濃度增加促進MSCs增殖，當bFGF濃度大于10ng/ml時促增殖作用下降。以不同濃度標記發(fā)現(xiàn) 10umol/L的 Brdu 最終標記率>95％，與 15umol/L的 Brdu 沒有顯著差別，與 5umol/L有顯著差異。隨著標記時間延長陽性細胞數(shù)增多標記 72 h 細胞陽性率 >

5、94％，但標記時間繼續(xù)延長標記細胞數(shù)目無明顯增多。而用CFDA標記MSCs，培養(yǎng)四小時后發(fā)現(xiàn)2 umol/l組的細胞標記率就已經(jīng)達到了97％以上，與更大濃度組沒有顯著差異，與1 umol/l組有顯著差異。骨髓間充質(zhì)干細胞復合bFGF修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)果觀察顯示4周后，A組軟骨缺損內(nèi)被白色透明膜樣組織部分充填，缺損深部由類似于透明軟骨的修復組織所填充、可見大量軟骨細胞位于特異性陷窩內(nèi)，甲苯胺藍和Masson染色后均未見明顯的軟骨細胞外

6、基質(zhì)形成。B組軟骨缺損內(nèi)雖也有膜樣物質(zhì)充填，但顏色明顯發(fā)紅，與周圍軟骨界限明顯。C組軟骨缺損內(nèi)主要由暗紅色組織組成，甲苯胺藍和Masson染色染色陰性。8周后，A組修復組織色澤灰白，表面平整，與周圍組織整合較好，但可清楚分辨出缺損處的邊界。修復組織由軟骨樣細胞構(gòu)成，出現(xiàn)軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，細胞數(shù)量多，排列不規(guī)則。甲苯胺藍染色陽性基質(zhì)含量較高，Masson染色示膠原染色陽性。B組缺損處修復組織顏色發(fā)白，表面較平整，與周圍組織整合較好。甲苯胺藍染

7、色陽性基質(zhì)較前組為少，Masson染色染色弱陽性。C組修復區(qū)為纖維狀物覆蓋，顏色不均一。C組缺損區(qū)為纖維組織覆蓋，表面明顯凹陷，修復區(qū)邊緣部分甲苯胺藍染色及Masson染色弱陽性。12周后，A組修復的關(guān)節(jié)面較光滑，修復組織與周圍軟骨基本整合，色澤相近，辨認困難，修復組織表面平整，和周圍軟骨整合緊密、厚度相近，甲苯胺藍染色在缺損修復表面可以見到與鄰近軟骨相連續(xù)的排列規(guī)整的異染質(zhì)，Masson染色示膠原染色陽性。B組修復處表面仍不完全平整，

8、色澤發(fā)白，但修復組織質(zhì)地仍較軟。甲苯胺藍染色也可見到異染質(zhì)，但出現(xiàn)分層現(xiàn)象，且與鄰近軟骨不連續(xù)，Masson染色示膠原染色弱陽性。C組缺損處凹陷為纖維狀物覆蓋。缺損區(qū)表面凹陷，與正常軟骨連接處表面纖維組織毛糙，細胞外基質(zhì)排列紊亂，甲苯胺藍染色和Masson染色僅在修復組織的底部見到少量的異染質(zhì)和膠原染色陽性。術(shù)后12周組織工程評分A組，B組，C組分別為11.35±1.69，8.29±1.98，2.97±1.24。
　　 結(jié)論:<

9、br>　　 1.骨髓間充質(zhì)干細胞運用于軟骨修復研究的可行性存在，擴增方便迅速，修復軟骨缺損有效，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 2.bFGF是骨髓間充質(zhì)干細胞生長分化重要的細胞因子，對于骨髓間充質(zhì)干細胞的促增殖作用顯著，在體內(nèi)可以促進軟骨組織形成。
　　 3.CFDA SE標記骨髓間充質(zhì)干細胞標記率高，且觀察方法簡便，不影響細胞增殖分化能力，可以應(yīng)用于軟骨組織工程研究。
　　 4．加入了氨甲環(huán)酸的纖維蛋白凝膠具有較