乳腺癌耐藥蛋白高表達(dá)耐藥細(xì)胞系的建立及其耐藥機(jī)制.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定表達(dá)乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)的小鼠成纖維細(xì)胞系PA317/BCRP，進(jìn)一步研究BCRP相關(guān)的耐藥功能，初步探討其耐藥機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)其耐藥提供依據(jù)。 方法：首先，從表達(dá)BCRP的乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞系MCF-7/Adr中，克隆出BCRP基因。將BCRP編碼序列克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.ColiDH5α，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP，酶切并測(cè)序鑒定。我們將測(cè)序正確的質(zhì)粒用電穿孔法轉(zhuǎn)染PA

2、317細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/EGFP以觀察轉(zhuǎn)染率。G418篩選陽(yáng)性克隆，有限稀釋法獲取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)。從G418篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測(cè)BCRP的mRNA表達(dá)，運(yùn)用WESTERNBLOT法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BCRP蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。經(jīng)驗(yàn)證正確的耐藥克隆命名為PA317/BCRP，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。為驗(yàn)證其耐藥功能，我們采用MTT法檢測(cè)PA317/BCRP細(xì)胞對(duì)米托葸醌(Mitoxantr

3、one，MTZ)耐藥性，羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外排羅丹明123功能，均以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的PA317細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。此外，應(yīng)用Westernblot檢測(cè)PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游靶點(diǎn)AKT表達(dá)含量的變化，以初步探討其細(xì)胞耐藥機(jī)制。 結(jié)果：成功構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP，轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞后經(jīng)G418篩選，克隆化培養(yǎng)后獲得兩株抗藥性細(xì)胞系。經(jīng)RT-PCR法，Westernblot和免疫組化法驗(yàn)證，均檢

4、測(cè)到細(xì)胞中BCRP基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。遂將驗(yàn)證正確的細(xì)胞系命名為PA317/BCRP，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組相比，PA317/BCRP細(xì)胞對(duì)MTZ耐藥性增強(qiáng)，且外排羅丹明123能力增強(qiáng)。耐藥機(jī)制方面，我們經(jīng)檢測(cè)PI3K-AKT途徑下游靶點(diǎn)AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP細(xì)胞內(nèi)明顯增高，其磷酸化AKT蛋白含量為PA317/pcDNA3.1細(xì)胞的10.87倍，為未轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞的13.18倍。

5、 結(jié)論：1、成功獲得穩(wěn)定表達(dá)BCRP的PA317細(xì)胞系--PA317/BCRP，經(jīng)MTT和羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相對(duì)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞，其耐藥和外排功能增強(qiáng)。該耐藥細(xì)胞系的建立，為研究BCRP腫瘤多藥耐藥提供了研究平臺(tái)。2、通過(guò)檢測(cè)PA317/BCRP細(xì)胞PI3K-AKT途徑下游靶點(diǎn)AKT的表達(dá)，我們觀察到耐藥細(xì)胞的AKT表達(dá)含量明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為BCRP可能通過(guò)影響AKT