XIAP siRNA增加HL-60細胞對阿霉素敏感性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：利用RNA干擾技術(shù)抑制XIAP在人白血病細胞HL-60中的表達，觀察siRNA干擾后HL-60細胞對化療藥物阿霉素處理的敏感性。 方法： 1.根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計原則, 運用生物信息學設(shè)計出XIAP 4個位點的干擾序列，運用PCR產(chǎn)生siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs),然后分別轉(zhuǎn)染指數(shù)生長期的HL-60細胞, 用實時定量熒光PCR檢測XIAP mRNA，篩選出抑

2、制效率較高的siRNA序列。將篩選出的siRNA序列插入siRNA真核表達質(zhì)粒psilencircle中，構(gòu)建psilecircle-XIAPsi，并構(gòu)建相應的siRNA亂序?qū)φ毡磉_質(zhì)粒psilecircle-XIAPsc。 2. Psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc分別轉(zhuǎn)染HL-60細胞，挑選穩(wěn)定表達psilecircle-XIAPsi的細胞克隆，實時定量熒光PCR檢測XIAP的mRNA水

3、平的變化，Western blot檢測XIAP蛋白水平的變化。用MTT法檢測穩(wěn)定表達此載體的腫瘤細胞對阿霉素敏感性的變化, Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標記，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。 結(jié)果：在待選的四個siRNA干擾位點中，位點（94-112）抑制效率最高，可達到83.1％。構(gòu)建psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc，StuⅠ酶切電泳，可見4800bp左右的條帶，DAN測序結(jié)果

4、與設(shè)計序列一致，表明psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc真核表達載體構(gòu)建成功。Psilecircle-XIAPsi轉(zhuǎn)染HL-60細胞表達后，實時定量熒光PCR檢測XIAP mRNA、Western blot檢測XIAP蛋白，與未轉(zhuǎn)染組相比明顯抑制了XIAP蛋白的表達；MTT檢測細胞對阿霉素的敏感性，與未轉(zhuǎn)染組相比敏感性增加了4倍；用阿霉素作用48h后，Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標記，

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