動(dòng)眼神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生和電刺激對(duì)其作用的研究.pdf

1、顱腦損傷、顱底和眶內(nèi)腫瘤手術(shù)常造成動(dòng)眼神經(jīng)損傷，導(dǎo)致眼球運(yùn)動(dòng)和瞳孔括約肌功能障礙，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。目前尚缺乏有效動(dòng)眼神經(jīng)修復(fù)方法，因此研究動(dòng)眼神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生和功能修復(fù)機(jī)制可為最終成功修復(fù)動(dòng)眼神經(jīng)及其他顱神經(jīng)損傷提供理論與技術(shù)支持。一些學(xué)者已應(yīng)用各種動(dòng)物模型研究動(dòng)眼神經(jīng)再生機(jī)制，并證明動(dòng)眼神經(jīng)損傷修復(fù)后存在解剖學(xué)上再生和功能恢復(fù)。然而在這些研究中均未詳細(xì)描述顱內(nèi)段動(dòng)眼神經(jīng)和眼外肌手術(shù)入路、應(yīng)用解剖以及動(dòng)物模型建立方法，而且目前

2、實(shí)驗(yàn)和臨床研究應(yīng)用的神經(jīng)電刺激和肌電圖記錄方法并不適合于長期和動(dòng)態(tài)顱神經(jīng)再生電生理學(xué)研究。盡管從倫理、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用觀點(diǎn)看，小動(dòng)物常被用于顱神經(jīng)再生研究，然而由于受到手術(shù)野局限，很難實(shí)施復(fù)雜顱內(nèi)和眼部手術(shù)，在這種情況下自然考慮應(yīng)用較大動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。作為研究動(dòng)眼神經(jīng)損傷后再生和電刺激對(duì)神經(jīng)再生作用的基礎(chǔ)工作，我們構(gòu)建了安全、實(shí)用的犬動(dòng)眼神經(jīng)損傷和電刺激模型，進(jìn)一步研究了正常犬動(dòng)眼神經(jīng)功能、組織學(xué)和下斜肌電生理學(xué)基本特征。 目的：

3、 （1）研究正常成年犬動(dòng)眼神經(jīng)核和副核是否存在神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化現(xiàn)象。 （2）研究動(dòng)眼神經(jīng)損傷是否可誘導(dǎo)成年犬動(dòng)眼神經(jīng)核和副核神經(jīng)細(xì)胞再生以及新生神經(jīng)細(xì)胞來源和類型。 （3）研究動(dòng)眼神經(jīng)損傷后動(dòng)眼神經(jīng)核和副核神經(jīng)細(xì)胞再生規(guī)律及其可能機(jī)制，以及神經(jīng)細(xì)胞再生與動(dòng)眼神經(jīng)功能修復(fù)的相關(guān)性。 方法： 1.動(dòng)物分組和動(dòng)眼神經(jīng)損傷 2.BrdU注射 3.組織制備和切片 4.免疫組織化學(xué)

4、 結(jié)果： 1.動(dòng)物一般情況 用以上手術(shù)方法充分顯露動(dòng)眼神經(jīng)海綿竇后段和下斜肌，安全、可靠地植入動(dòng)眼神經(jīng)刺激電極和下斜肌肌電圖記錄電極；可通過各種方式進(jìn)行神經(jīng)干預(yù)。所有動(dòng)物術(shù)后生存和手術(shù)切口愈合良好，無顱內(nèi)和眼部感染以及手術(shù)并發(fā)的角膜潰瘍，死亡率為0％。除實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)損傷引起的動(dòng)眼神經(jīng)完全麻痹外，無偏癱、癲癇等神經(jīng)功能障礙并發(fā)癥。 2.模型評(píng)估 正常犬瞳孔直徑3.92±0.80mm，對(duì)光反射靈敏，瞳孔中心

5、至外眥內(nèi)側(cè)緣距離（Dpc）和瞼裂大小（PFS）分別為9.97±1.11mm和10.91±1.37mm，眼球運(yùn)動(dòng)靈活。所有動(dòng)眼神經(jīng)壓榨損傷動(dòng)物術(shù)后立即出現(xiàn)術(shù)側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)完全麻痹表現(xiàn)。神經(jīng)組織學(xué)檢查顯示，動(dòng)眼神經(jīng)損傷處所有軸突均被切斷但神經(jīng)鞘膜保持完整。實(shí)驗(yàn)期間所有植入電極均穩(wěn)定、有效工作，無扭曲、折斷和脫出，沒有引起顱內(nèi)和/或眶內(nèi)感染和動(dòng)眼神經(jīng)副損傷。 3.動(dòng)眼神經(jīng)組織學(xué)特征 健康成年犬動(dòng)眼神經(jīng)從出中腦處至進(jìn)入眼外肌長1.9

6、6±0.15cm，由10，282.00±1，195.66根神經(jīng)纖維組成；有髓神經(jīng)纖維8，875.00±1，088.72根、占神經(jīng)纖維總數(shù)的86.32±0.55％，平均直徑10.61±0.72μm，軸突平均直徑6.46±0.41μm，平均髓鞘厚度2.08±0.27μm；無髓神經(jīng)纖維1407.00±108.22根、占神經(jīng)纖維總數(shù)的13.68±0.55％，平均直徑0.45±0.23μm。 4.下斜肌電生理學(xué)特征 清醒健康犬眼球

7、處于休息位，下斜肌無正常和/或異常自發(fā)電活動(dòng)；聲/光誘導(dǎo)眼球運(yùn)動(dòng)時(shí)，正常運(yùn)動(dòng)單位電位（MUPs）波形一致，2～4位相，時(shí)程3.16±0.15ms，波幅524.18±133.89μvolt，募集相正常，無多相波。神經(jīng)超強(qiáng)刺激（1.8 volt）時(shí)，復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAPs）潛伏期2.91±0.03ms、波幅526.67±15.89μvolt、時(shí)程4.28±0.21ms。 5.圖像分析 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)論：

8、 （1）正常成年犬動(dòng)眼神經(jīng)核和副核不存在細(xì)胞有絲分裂活性、神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化以及新生神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，但可能具有休眠的神經(jīng)細(xì)胞再生特性。 （2）成年犬動(dòng)眼神經(jīng)損傷可誘導(dǎo)其動(dòng)眼神經(jīng)核和副核持續(xù)存在神經(jīng)細(xì)胞再生，激活神經(jīng)干細(xì)胞持續(xù)增殖并分化形成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)新生神經(jīng)元細(xì)胞分裂、成熟、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖以及可能的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。 （3）動(dòng)眼神經(jīng)損傷后動(dòng)眼神經(jīng)核和副核內(nèi)的新生神經(jīng)元細(xì)胞可能來源于神經(jīng)干細(xì)

9、胞分化和可能存在的休眠未成熟神經(jīng)元細(xì)胞激活。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及軸突切斷神經(jīng)元或新生神經(jīng)元細(xì)胞生存。 （4）動(dòng)眼神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的動(dòng)眼神經(jīng)核和副核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞再生可能是眼外肌和瞳孔括約肌功能恢復(fù)的細(xì)胞基礎(chǔ)之一。 3.神經(jīng)解剖學(xué) （1）動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)HRP標(biāo)記神經(jīng)元分布 與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組4周時(shí)雙側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)HRP逆行標(biāo)記神經(jīng)元分布范圍無明顯減小，分布較稀疏，動(dòng)眼神經(jīng)核功能分區(qū)特征消失；

10、6～12周時(shí)雙側(cè)神經(jīng)元分布范圍均較4周和正常組明顯減小，分布相對(duì)比較集中、密度增大、但仍比正常組稀疏，功能分區(qū)特征接近正常。在各時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組HRP標(biāo)記神經(jīng)元在雙側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)分布范圍均無明顯減小，分布比較稀疏，4～8周時(shí)功能分區(qū)特征消失、12周時(shí)比較明顯。 （2）動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)HRP標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)和分布比率 動(dòng)眼神經(jīng)損傷后4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)核中HRP標(biāo)記神經(jīng)元總數(shù)明顯少于正常組；6、8和12周時(shí)均與正常組無顯

11、著差異。對(duì)照組4和6周時(shí)HRP標(biāo)記神經(jīng)元總數(shù)均明顯少于正常組；8和12周時(shí)與正常組無明顯差異。兩組神經(jīng)元總數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均無差異。 實(shí)驗(yàn)組6、8和12周時(shí)同側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)HRP標(biāo)記神經(jīng)元分布比率均與正常組無差異，明顯大于4周時(shí)。在各時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組同側(cè)HRP標(biāo)記神經(jīng)元分布比率無明顯差異，均小于正常組和實(shí)驗(yàn)組。兩組對(duì)側(cè)動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元分布比率均呈反相改變。 （3）HRP標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元直徑 實(shí)驗(yàn)組4和6周時(shí)HRP標(biāo)記神

12、經(jīng)元直徑均明顯大于正常組，8和12周時(shí)均與正常組無明顯差異。對(duì)照組4、6和8周時(shí)神經(jīng)元直徑明顯大于正常組，12周時(shí)與正常組無明顯差異。在各時(shí)間點(diǎn)，兩組神經(jīng)元直徑均差異不明顯。 4.動(dòng)眼神經(jīng)神經(jīng)組織學(xué) （1）動(dòng)眼神經(jīng)組織形態(tài) 動(dòng)眼神經(jīng)損傷后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組神經(jīng)損傷點(diǎn)和遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維均Wallerian變性，炎性細(xì)胞浸潤，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)變性更劇烈。實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)端新生神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)4周時(shí)明顯恢復(fù)、炎性細(xì)胞數(shù)量明顯

13、減少，12周時(shí)神經(jīng)纖維形態(tài)接近正常神經(jīng)；對(duì)照組4周時(shí)遠(yuǎn)端神經(jīng)變性仍較嚴(yán)重、大量炎性細(xì)胞浸潤，6～8周時(shí)新生神經(jīng)纖維形態(tài)明顯恢復(fù)、炎性細(xì)胞較多，12周時(shí)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步恢復(fù)。 （2）神經(jīng)纖維數(shù)量 在各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組神經(jīng)纖維總數(shù)、有髓和無髓神經(jīng)纖維數(shù)量均差異不明顯。實(shí)驗(yàn)組4周時(shí)神經(jīng)纖維總數(shù)少于正常組，6、8和12周時(shí)均與正常組無顯著差異；在各時(shí)間點(diǎn)有髓神經(jīng)纖維數(shù)量均與正常組差異不明顯。對(duì)照組4和6周時(shí)神經(jīng)纖維總數(shù)均

14、少于正常組，8和12周時(shí)均與正常組差異不顯著；4周時(shí)有髓神經(jīng)纖維數(shù)量少于正常組，6、8和12周時(shí)與正常組無明顯差異。兩組無髓神經(jīng)纖維在各時(shí)間點(diǎn)均明顯少于正常組。 （3）有髓神經(jīng)纖維直徑和直徑分布 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有髓神經(jīng)纖維平均直徑在各時(shí)間點(diǎn)均小于正常組。4周時(shí)兩組無明顯差異，6、8和12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組均明顯大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組6周時(shí)有髓神經(jīng)纖維直徑明顯增大，12周時(shí)直徑雙峰分布特征明顯恢復(fù)；對(duì)照組4～12周有髓神經(jīng)纖維直徑無明

15、顯變化。 （4）有髓神經(jīng)纖維軸突直徑 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有髓神經(jīng)纖維軸突平均直徑在各時(shí)間點(diǎn)均小于正常組。4周時(shí)兩組無明顯差異，6、8和12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組均明顯大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在6和12周時(shí)有髓神經(jīng)纖維軸突直徑明顯增大。 （5）有髓神經(jīng)纖維髓鞘厚度 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有髓神經(jīng)纖維平均髓鞘厚度在各時(shí)間點(diǎn)均小于正常組。4周時(shí)兩組無明顯差異，6、8和12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組均明顯大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組6周時(shí)有髓神經(jīng)纖維髓鞘厚

16、度明顯增大，對(duì)照組4～12周無明顯變化。 （6）有髓神經(jīng)纖維數(shù)量與HRP標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量比值 實(shí)驗(yàn)組6周時(shí)Rfc值明顯小于4周、大于正常組，8和12周時(shí)均與正常組無明顯差異。對(duì)照組4、6和8周時(shí)Rfc值均大于正常組，12周時(shí)與正常組無明顯差異。各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組Rfc值均小于對(duì)照組。 結(jié)論： （1）動(dòng)眼神經(jīng)損傷后，神經(jīng)電刺激可提高眼外肌和瞳孔括約肌功能以及眼外肌電生理功能恢復(fù)速度和最終恢復(fù)水平；眼外肌電生理

17、功能恢復(fù)速度和程度均優(yōu)于其收縮運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，通過分析眼外肌肌電圖，可預(yù)測(cè)其功能恢復(fù)時(shí)程、評(píng)估其最終恢復(fù)水平。 （2）神經(jīng)電刺激可加速動(dòng)眼神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生進(jìn)程，促進(jìn)眼外肌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、功能恢復(fù)和新生軸突芽枝；減少芽生軸突迷行生長，提高其對(duì)眼外肌特異性神經(jīng)再支配恢復(fù)速度和程度；加快新生神經(jīng)纖維生長速度，提高其組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度和最終恢復(fù)水平。 （3）動(dòng)眼神經(jīng)損傷后，動(dòng)眼神經(jīng)核解剖學(xué)和動(dòng)眼神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)速度和程度決定眼外