動眼神經損傷后神經再生和電刺激對其作用的研究.pdf

1、顱腦損傷、顱底和眶內腫瘤手術常造成動眼神經損傷，導致眼球運動和瞳孔括約肌功能障礙，嚴重影響病人的生活質量。目前尚缺乏有效動眼神經修復方法，因此研究動眼神經損傷后神經再生和功能修復機制可為最終成功修復動眼神經及其他顱神經損傷提供理論與技術支持。一些學者已應用各種動物模型研究動眼神經再生機制，并證明動眼神經損傷修復后存在解剖學上再生和功能恢復。然而在這些研究中均未詳細描述顱內段動眼神經和眼外肌手術入路、應用解剖以及動物模型建立方法，而且目前

2、實驗和臨床研究應用的神經電刺激和肌電圖記錄方法并不適合于長期和動態(tài)顱神經再生電生理學研究。盡管從倫理、經濟和實用觀點看，小動物常被用于顱神經再生研究，然而由于受到手術野局限，很難實施復雜顱內和眼部手術，在這種情況下自然考慮應用較大動物進行實驗研究。作為研究動眼神經損傷后再生和電刺激對神經再生作用的基礎工作，我們構建了安全、實用的犬動眼神經損傷和電刺激模型，進一步研究了正常犬動眼神經功能、組織學和下斜肌電生理學基本特征。 目的：

3、 （1）研究正常成年犬動眼神經核和副核是否存在神經細胞增殖、分化現象。 （2）研究動眼神經損傷是否可誘導成年犬動眼神經核和副核神經細胞再生以及新生神經細胞來源和類型。 （3）研究動眼神經損傷后動眼神經核和副核神經細胞再生規(guī)律及其可能機制，以及神經細胞再生與動眼神經功能修復的相關性。 方法： 1.動物分組和動眼神經損傷 2.BrdU注射 3.組織制備和切片 4.免疫組織化學

4、 結果： 1.動物一般情況 用以上手術方法充分顯露動眼神經海綿竇后段和下斜肌，安全、可靠地植入動眼神經刺激電極和下斜肌肌電圖記錄電極；可通過各種方式進行神經干預。所有動物術后生存和手術切口愈合良好，無顱內和眼部感染以及手術并發(fā)的角膜潰瘍，死亡率為0％。除實驗性神經損傷引起的動眼神經完全麻痹外，無偏癱、癲癇等神經功能障礙并發(fā)癥。 2.模型評估 正常犬瞳孔直徑3.92±0.80mm，對光反射靈敏，瞳孔中心

5、至外眥內側緣距離（Dpc）和瞼裂大?。≒FS）分別為9.97±1.11mm和10.91±1.37mm，眼球運動靈活。所有動眼神經壓榨損傷動物術后立即出現術側動眼神經完全麻痹表現。神經組織學檢查顯示，動眼神經損傷處所有軸突均被切斷但神經鞘膜保持完整。實驗期間所有植入電極均穩(wěn)定、有效工作，無扭曲、折斷和脫出，沒有引起顱內和/或眶內感染和動眼神經副損傷。 3.動眼神經組織學特征 健康成年犬動眼神經從出中腦處至進入眼外肌長1.9

6、6±0.15cm，由10，282.00±1，195.66根神經纖維組成；有髓神經纖維8，875.00±1，088.72根、占神經纖維總數的86.32±0.55％，平均直徑10.61±0.72μm，軸突平均直徑6.46±0.41μm，平均髓鞘厚度2.08±0.27μm；無髓神經纖維1407.00±108.22根、占神經纖維總數的13.68±0.55％，平均直徑0.45±0.23μm。 4.下斜肌電生理學特征 清醒健康犬眼球

7、處于休息位，下斜肌無正常和/或異常自發(fā)電活動；聲/光誘導眼球運動時，正常運動單位電位（MUPs）波形一致，2～4位相，時程3.16±0.15ms，波幅524.18±133.89μvolt，募集相正常，無多相波。神經超強刺激（1.8 volt）時，復合肌肉動作電位（CMAPs）潛伏期2.91±0.03ms、波幅526.67±15.89μvolt、時程4.28±0.21ms。 5.圖像分析 6.統(tǒng)計學分析 結論：

8、 （1）正常成年犬動眼神經核和副核不存在細胞有絲分裂活性、神經干細胞增殖和分化以及新生神經元細胞和星形膠質細胞增殖，但可能具有休眠的神經細胞再生特性。 （2）成年犬動眼神經損傷可誘導其動眼神經核和副核持續(xù)存在神經細胞再生，激活神經干細胞持續(xù)增殖并分化形成神經元和星形膠質細胞，誘導新生神經元細胞分裂、成熟、星形膠質細胞增殖以及可能的小膠質細胞反應。 （3）動眼神經損傷后動眼神經核和副核內的新生神經元細胞可能來源于神經干細

9、胞分化和可能存在的休眠未成熟神經元細胞激活。星形膠質細胞反應可促進神經干細胞增殖、分化及軸突切斷神經元或新生神經元細胞生存。 （4）動眼神經損傷誘導的動眼神經核和副核內神經細胞再生可能是眼外肌和瞳孔括約肌功能恢復的細胞基礎之一。 3.神經解剖學 （1）動眼神經核內HRP標記神經元分布 與正常組相比，實驗組4周時雙側動眼神經核內HRP逆行標記神經元分布范圍無明顯減小，分布較稀疏，動眼神經核功能分區(qū)特征消失；

10、6～12周時雙側神經元分布范圍均較4周和正常組明顯減小，分布相對比較集中、密度增大、但仍比正常組稀疏，功能分區(qū)特征接近正常。在各時間點，對照組HRP標記神經元在雙側動眼神經核內分布范圍均無明顯減小，分布比較稀疏，4～8周時功能分區(qū)特征消失、12周時比較明顯。 （2）動眼神經核內HRP標記運動神經元計數和分布比率 動眼神經損傷后4周時，實驗組雙側動眼神經核中HRP標記神經元總數明顯少于正常組；6、8和12周時均與正常組無顯

11、著差異。對照組4和6周時HRP標記神經元總數均明顯少于正常組；8和12周時與正常組無明顯差異。兩組神經元總數在各時間點均無差異。 實驗組6、8和12周時同側動眼神經核內HRP標記神經元分布比率均與正常組無差異，明顯大于4周時。在各時間點，對照組同側HRP標記神經元分布比率無明顯差異，均小于正常組和實驗組。兩組對側動眼神經核內神經元分布比率均呈反相改變。 （3）HRP標記運動神經元直徑 實驗組4和6周時HRP標記神

12、經元直徑均明顯大于正常組，8和12周時均與正常組無明顯差異。對照組4、6和8周時神經元直徑明顯大于正常組，12周時與正常組無明顯差異。在各時間點，兩組神經元直徑均差異不明顯。 4.動眼神經神經組織學 （1）動眼神經組織形態(tài) 動眼神經損傷后2周時，實驗組和對照組神經損傷點和遠端神經纖維均Wallerian變性，炎性細胞浸潤，與對照組相比實驗組神經變性更劇烈。實驗組遠端新生神經纖維結構4周時明顯恢復、炎性細胞數量明顯

13、減少，12周時神經纖維形態(tài)接近正常神經；對照組4周時遠端神經變性仍較嚴重、大量炎性細胞浸潤，6～8周時新生神經纖維形態(tài)明顯恢復、炎性細胞較多，12周時神經纖維結構進一步恢復。 （2）神經纖維數量 在各時間點，實驗組和對照組神經纖維總數、有髓和無髓神經纖維數量均差異不明顯。實驗組4周時神經纖維總數少于正常組，6、8和12周時均與正常組無顯著差異；在各時間點有髓神經纖維數量均與正常組差異不明顯。對照組4和6周時神經纖維總數均

14、少于正常組，8和12周時均與正常組差異不顯著；4周時有髓神經纖維數量少于正常組，6、8和12周時與正常組無明顯差異。兩組無髓神經纖維在各時間點均明顯少于正常組。 （3）有髓神經纖維直徑和直徑分布 實驗組和對照組有髓神經纖維平均直徑在各時間點均小于正常組。4周時兩組無明顯差異，6、8和12周時實驗組均明顯大于對照組。實驗組6周時有髓神經纖維直徑明顯增大，12周時直徑雙峰分布特征明顯恢復；對照組4～12周有髓神經纖維直徑無明

15、顯變化。 （4）有髓神經纖維軸突直徑 實驗組和對照組有髓神經纖維軸突平均直徑在各時間點均小于正常組。4周時兩組無明顯差異，6、8和12周時實驗組均明顯大于對照組。實驗組和對照組分別在6和12周時有髓神經纖維軸突直徑明顯增大。 （5）有髓神經纖維髓鞘厚度 實驗組和對照組有髓神經纖維平均髓鞘厚度在各時間點均小于正常組。4周時兩組無明顯差異，6、8和12周時實驗組均明顯大于對照組。實驗組6周時有髓神經纖維髓鞘厚

16、度明顯增大，對照組4～12周無明顯變化。 （6）有髓神經纖維數量與HRP標記運動神經元數量比值 實驗組6周時Rfc值明顯小于4周、大于正常組，8和12周時均與正常組無明顯差異。對照組4、6和8周時Rfc值均大于正常組，12周時與正常組無明顯差異。各時間點實驗組Rfc值均小于對照組。 結論： （1）動眼神經損傷后，神經電刺激可提高眼外肌和瞳孔括約肌功能以及眼外肌電生理功能恢復速度和最終恢復水平；眼外肌電生理

17、功能恢復速度和程度均優(yōu)于其收縮運動功能恢復，通過分析眼外肌肌電圖，可預測其功能恢復時程、評估其最終恢復水平。 （2）神經電刺激可加速動眼神經損傷后神經再生進程，促進眼外肌運動神經元存活、功能恢復和新生軸突芽枝；減少芽生軸突迷行生長，提高其對眼外肌特異性神經再支配恢復速度和程度；加快新生神經纖維生長速度，提高其組織結構恢復速度和最終恢復水平。 （3）動眼神經損傷后，動眼神經核解剖學和動眼神經組織結構的恢復速度和程度決定眼外