芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝研究.pdf

1、赤芍和白芍為我國常用中藥材。赤芍為毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch.）直接使用的干燥根，白芍為植物芍藥水煮去皮后使用的干燥根。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是赤芍和白芍的兩種主要有效成分。本文采用體內(nèi)和體外研究方法分別對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷進行了代謝研究。通過微生物轉化、腸內(nèi)菌溫孵、肝微粒體溫孵等技術研究二者的體外代謝，采用HPLC-MS/MS技術分析灌胃給藥后的

2、大鼠尿液、膽汁中的代謝物，初步探討了二者體外模型中的相互轉化以及體內(nèi)和體外研究結果的相關性。同時對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷與人、大鼠的血漿蛋白結合率進行了測定。本研究對明確芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷體內(nèi)過程進而闡述白芍和赤芍藥材的體內(nèi)行為具有重要意義，為中藥的代謝研究做出了有價值的探索。
　　 第一部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷微生物轉化研究
　　 目的：研究芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的微生物轉化，分離鑒定轉化產(chǎn)物。
　　 方法：從18種真菌

3、中篩選出分別對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷有轉化能力的菌株，從中各選出1株轉化能力強的菌株進行轉化放大實驗，分別采用硅膠、ODS填充柱色譜和制備高效液相色譜等技術分離純化轉化產(chǎn)物，通過HPLC-MS和NMR技術鑒定轉化產(chǎn)物結構。
　　 結果：對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷轉化能力較強的菌株分別是短刺小克銀漢霉AS3.970和總狀共頭霉.AS3.264。在短刺小克銀漢霉.AS3.970對芍藥苷的轉化液中分離得到了芍藥內(nèi)酯苷，在總狀共頭霉AS3.264

4、對芍藥內(nèi)酯苷的轉化液中分離得到了芍藥苷。
　　 結論：特定條件下，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷可以相互轉化。
　　 第二部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷腸內(nèi)菌代謝研究
　　 目的：通過離體實驗研究大鼠腸內(nèi)菌對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝，體外制備代謝產(chǎn)物并確定其化學結構。
　　 方法：分別將芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷加至大鼠新鮮糞便中，于無氧條件下培養(yǎng)1、2、6、10、12、18、24、30、36 h時，吸取1 mL用等量的乙酸乙酯萃取

5、3次，渦旋混勻后取上層液氮氣吹干，殘渣用甲醇溶解后取樣20μL經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后用于HPLC-MS分析，并根據(jù)在各自最大吸收波長時積分所得峰面積和標準曲線求得芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量，其他代謝物為相對含量。再分別取一定時間點的轉化液經(jīng)高效液相色譜法制備與純化，回收有機溶劑后凍干分別得到芍藥苷轉化產(chǎn)物M1和芍藥內(nèi)酯苷轉化產(chǎn)物M2，采用核磁共振波譜進行結構確證。
　　 結果：轉化曲線的結果表明，芍藥苷1 h后已經(jīng)開始轉化，

6、轉化產(chǎn)物M1的量不斷增大，到24 h達到轉化平衡，30 h時已經(jīng)開始轉化成其他代謝物；芍藥內(nèi)酯苷2 h時已經(jīng)開始發(fā)生化，轉化產(chǎn)物M2在30 h時達到平衡，后轉化為其他代謝物。HPLC-MS和NMR的分析表明芍藥苷可被大鼠腸內(nèi)菌代謝成芍藥內(nèi)酯苷，芍藥內(nèi)酯苷可被大鼠腸內(nèi)菌代謝成芍藥苷。
　　 結論：芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠腸內(nèi)菌群的作用下可以發(fā)生互相轉化。
　　 第三部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷肝微粒體代謝研究
　　 目的

7、：研究芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷經(jīng)肝微粒體溫孵后的代謝產(chǎn)物。
　　 方法：根據(jù)文獻報道的方法將芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別加入微粒體溫孵液中，溫孵一定時間后，處理并采用HPLC-DAD分析，確認代謝物。
　　 結果：經(jīng)過多次實驗，在大、小鼠肝微粒體中均未發(fā)現(xiàn)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝物。
　　 結論：肝微粒體對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝作用微弱。
　　 第四部分 HPLC-MS/MS初步分析大鼠尿液和膽汁中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯

8、苷的代謝物
　　 目的：分析推測芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物。
　　 方法：分別灌胃給予雄性SD大鼠芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷藥液后，收集24 h內(nèi)的尿液，用等量乙酸乙酯萃取3次，氮氣吹干，殘渣用甲醇100μL溶解，取樣用于HPLC-MS分析；膽管插管收集24 h內(nèi)膽汁，直接濃縮，0.45μm微孔濾膜過濾后，取樣用于HPLC-MS分析，分析推測代謝物。
　　 結果：在口服芍藥苷的大鼠尿中檢測到6種代謝產(chǎn)

9、物，推測其分別為單氧化、三氧化、單甲基化、雙甲基化、與水結合和葡萄糖苷酸化的產(chǎn)物。在口服芍藥內(nèi)酯苷的大鼠尿中檢測到7種代謝產(chǎn)物，推測其分別為去甲基化、雙氧化、與1分子葡萄糖結合和雙氧化、與1分子葡萄糖結合、與2分子葡萄糖結合和發(fā)生谷胱甘肽反應反應的產(chǎn)物；同時在膽汁中也發(fā)現(xiàn)了5種代謝產(chǎn)物，分別為去甲基化、雙氧化、三氧化、與1分子葡萄糖結合、葡萄糖苷酸化的產(chǎn)物。
　　 結論：HPLC-MS/MS法可以快速、簡捷、準確地分析在芍藥苷和

10、芍藥內(nèi)酯苷大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。體內(nèi)和體外分析的結果表明二者存在一定的聯(lián)系。在體外微生物和腸內(nèi)菌的代謝模型中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷發(fā)生了相互轉化，說明所選的藥用真菌和腸內(nèi)菌中含有相同的酶系；而在體內(nèi)尿液和膽汁中未見這種轉化，可能是含有的酶不同，也可能是其他原因，有待進一步研究。
　　 第五部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷體外大鼠和人血漿蛋白結合率的測定
　　 目的：建立芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠血漿和人血漿中蛋白結合率的測定方法。

11、　　 方法：采用平衡透析法測定血漿蛋白結合率，將透析液置冰箱內(nèi)（溫度約4℃）平衡透析，確定48 h即可透析至平衡。采用高效液相色譜法測定血漿中藥物總濃度和游離藥物濃度，計算血漿蛋白結合率。
　　 結果：1、5、10、15、20、30μg/ml的芍藥苷與大鼠血漿蛋白結合率分別為60.45％、67.60％、78.66％、74.07％、76.29％、74.27％；1、5、10、15、20、30μg/ml的芍藥內(nèi)酯苷與大鼠血漿蛋白結合