基于RNa-Seq技術(shù)對臍橙果皮光澤型芽變果實發(fā)育期間蠟質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的研究.pdf

1、以紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮為實驗材料，提取兩者RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)，結(jié)合課題組前期對兩者果皮蠟質(zhì)成分差異分析結(jié)果，篩選果實發(fā)育期間可能的差異表達途徑以及差異表達基因，運用熒光定量PCR技術(shù)對篩選到的差異表達基因進行驗證，并對可能的關(guān)鍵基因進行克隆，從分子水平探討了紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙之間的差異，為改良臍橙品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.借助Illumin

2、a HiSeqTM2000測序平臺，對紐荷爾臍橙光澤型突變體果皮和母本紐荷爾臍橙果皮RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果如下:
　　(1)得到總reads共計77，339，480條，其中MT38，734，326條，WT38，605，154條。基因覆蓋度進行統(tǒng)計顯示MT與WT中覆蓋度在80％以上的均占到17％。
　　(2)得到差異表達基因4，959個（FDR≤0.001且差異倍數(shù)在2倍及以上），WT與MT相比，發(fā)生相對上調(diào)基因1，5

3、42個，發(fā)生相對下調(diào)基因3，417個。
　　(3)GO功能顯著性富集分析將差異表達基因注釋到三大功能條目:細胞組分、分子功能和生物過程。其中細胞器、催化活性功能和細胞過程所占比例最大，分別占到三個功能條目的76.7％，68.7％，74.7％。
　　(4)KEGG數(shù)據(jù)庫將差異基因富集到124條Pathway，其中富集最大的是代謝途徑747(23.22％)，其次是次級代謝產(chǎn)物生物合成452(14.05％)。
　　(5)優(yōu)化

4、了9，296個基因注釋結(jié)構(gòu)，補充或延長了它們3'UTR或5'UTR。
　　(6)發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本438個，其中MT216個，WT222個。438個新轉(zhuǎn)錄本中具有編譯能力的有75個，其中MT41個，WT34個。
　　(7)MT和WT中分別有707和607個基因發(fā)生可變剪接，其形式為IntronRetention。
　　(8)發(fā)現(xiàn)SNP共計84，090個，其中MT44，389個，WT39，701個。
　　2.結(jié)合RNA-

5、Seq數(shù)據(jù)與課題組前期紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮蠟質(zhì)差異成分分析結(jié)果，篩選蠟質(zhì)合成相關(guān)差異表達途徑，從中隨機選取差異表達基因并對其在果實發(fā)育期間相對表達量進行測量，在基因?qū)用娼忉尲~荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮蠟質(zhì)成分差異原因，結(jié)果如下:
　　(1)本實驗篩選了相關(guān)差異表達途徑6條，從中隨機選取16個差異表達基因，屬于7個基因家族。其中表達量相對上調(diào)基因3個，表達量相對下調(diào)基因13個。利用RT-q

6、PCR技術(shù)對16個差異表達基因在果實發(fā)育期間相對表達量進行測量，13個基因在果實整個發(fā)育期間連續(xù)表達，3個基因在發(fā)育期間間斷性表達。16個差異表達基因中有12個與測序結(jié)果相一致，表明RNA-Seq測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　(2)對比差異表達基因RT-qPCR結(jié)果與課題組前期紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙成熟時期果皮蠟質(zhì)差異成分分析結(jié)果，兩者結(jié)果完全一致。
　　3.利用RT-PCR技術(shù)和基因克隆技術(shù)對紐荷爾臍橙果皮光

7、澤型突變體(MT)和普通紐荷爾臍(WT)果皮CER1基因家族Cs4g02580，Cs1g02760基因，KCS基因家族Cs4g06430基因進行克隆，分別將其命名為CER1-1，CER1-2，KCS-1。分析結(jié)果如下:
　　(1)CER1-1 cDNA序列全長1，492bp，包含一個1，275bp的開放閱讀框，編碼424個氨基酸，MT與WT相比，CER1-1氨基酸序列有11個位點發(fā)生突變。
　　(2)CER1-2-MT cD