豬骨骼肌發(fā)育相關新基因家族BTG-TOB的克隆及功能研究.pdf

1、提高豬生產(chǎn)性狀一直以來都是育種學家們追求的目標之一。豬瘦肉產(chǎn)量和質量主要取決于胚胎發(fā)育期肌纖維數(shù)量的增生和生后期肌纖維體積的膨大。豬肌肉生長速度與胚胎期形成的肌纖維數(shù)目呈正相關,同時也受肌纖維中蛋白質的合成和降解速度差異的影響,但胚胎肌發(fā)生時期形成的肌纖維數(shù)量是動物產(chǎn)肉量的重要決定因素。另一方面,肌纖維的肥大又與肌肉應激或肉質下降等問題有關。因此,如何最有效地平衡肌肉生長速度與肌肉品質需要我們對肌纖維的發(fā)育有一個全面深入的了解。

2、　　 本實驗室在以通城和長白豬胚胎發(fā)育不同時期的骨骼肌構建的LongSAGE文庫中發(fā)現(xiàn)了一大批差異表達基因,本研究在此基礎上,選取對早期肌纖維增殖有顯著影響的BTG/TOB基因家族,開展了5個新基因的克隆、定位及其功能研究工作,得到如下結果:
　　 1.以LongSAGE文庫中差異表達標簽(tags)為基礎,結合生物信息學與實驗驗證克隆獲得了豬BTG1、BTG2和BTG3基因包含完整CDS的cDNA序列以及BTG4基因的部分D

3、NA序列和TOB2基因的靠近3’端部分cDNA序列。
　　 2.推導了豬BTG1、BTG2和BTG3基因的氨基酸序列,并利用生物信息學方法預測了它們的結構和功能,發(fā)現(xiàn)它們除具有BTG/TOB基因家族所共有的boxA和boxB保守結構域外,還含有幾個蛋白激酶的磷酸化位點。結合氨基酸同源性,我們構建了該三個基因的系統(tǒng)進化樹,結果表明,三個基因分別聚為三個明顯的分支,其中BTG1和BTG2進化關系更近一些。
　　 3.利用RH

4、克隆板對上述5個基因進行了染色體定位,分別將BTG1、BTG2、BTG3、BTG4及TOB2基因定位在SSC5q24-25,9p11-q11,13q47,9p21和5p15區(qū)域。
　　 4.運用RT-PCR方法檢測了BTG1,BTG2和BTG3三個基因在成年長白和通城豬心臟、胃、脾臟、肺、腎、肌肉中的表達情況。檢測結果表明,BTG1和BTG3基因在表達模式上類似,都在長白豬心臟和骨骼肌中低表達,而在通城豬高表達,在兩個品種的胃、

5、脾臟、肺和腎中表達都較高；BTG2基因在長白和通城豬的心臟中高表達,骨骼肌中表達稍低。
　　 5.運用實時定量PCR方法,我們利用與半定量PCR相同的反轉錄引物在通城和長白豬胚胎發(fā)育33天、65天和90天的背最長肌cDNA中對三個基因的表達情況作了檢測。檢測結果表明,BTG1基因和BTG3基因在兩個品種三個時期的表達模式完全一樣,它們在通城豬三個胚胎時期的表達量都遠大于在長白豬中的表達量(p<0.01),通城豬中的表達趨勢是先下

6、調再上調(p<0.05),在長白豬三個胚胎時期的表達差異不顯著；BTG2基因則在通城豬胚胎三個時期的表達是先上調再下調(p<0.05),在長白豬中的表達是先上調(p<0.05),在65天和90天的表達差異不顯著(p>0.05)。并且BTG2基因在33天和90天的表達都是長白豬大于通城豬(p<0.05),65天時則在兩個品種的表達沒顯著差異。
　　 6.運用實時定量PCR方法,檢測了鼠源BTG1,BTG2,BTG3和Myogeni

7、n基因在C2C12細胞分化不同時期的表達,Myogenin基因用作成肌細胞分化的信號分子。結果顯示BTG1和BTG3基因與Myogenin的表達趨勢完全一致(p<0.05),而BTG2基因則在五個時期呈現(xiàn)波浪式表達(p<0.05)。
　　 7.發(fā)現(xiàn)了豬BTG1、BTG2和BTG3基因可用PCR-RFLP方法檢測的4個SNP位點,其中位于BTG1基因3’UTR區(qū)的兩個SNP位點和位于BTG2基因第一外顯子的一個SNP位點都沒有改變

8、氨基酸,BTG3基因的SNP位于第五外顯子,該位點堿基C到T的改變造成氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸。
　　 8.對上述四個SNP位點在大白、長白、杜洛克、通城、二花臉、清平和江西玉山豬中進行群體遺傳學分析,分析結果表明四個SNP位點在中外豬品種中的分布存在顯著差異。
　　 9.在我室與通城縣畜牧局合作組建的試驗豬群體中,對四個SNP與生產(chǎn)性狀進行了初步關聯(lián)分析。結果顯示,BTG1基因3’UTR區(qū)PsuL-RFLP位點的基因型

9、與肩部膘厚、6-7肋間膘厚、屠宰率以及肉色存在顯著關聯(lián),該區(qū)Bsh1236I-RFLP位點的基因型與肉色及肌內(nèi)脂肪含量存在顯著關聯(lián)；BTG2基因第一外顯子Mval-RFLP多態(tài)性位點的基因型與肩部膘厚、肉色及肌肉剪切力存在顯著關聯(lián)；BTG3基因第五外顯子Mval-RFLP多態(tài)性位點的基因型與肌肉剪切力存在顯著關聯(lián)。
　　 10.成功克隆了豬BTG1基因上游約1.6kb的啟動子序列,并構建了4個pGL3報告基因載體并用生物信息學方

10、法對它的結構和轉錄因子結合位點進行了預測。發(fā)現(xiàn)了許多影響細胞周期和肌纖維發(fā)育的轉錄因子,如Forehead基因家族,AP-1樣因子,SP1樣因子,Myod,PAX家族等。對啟動子的預測結果表明,豬的BTG1基因可能是對肌肉早期發(fā)育有重要影響的基因。
　　 本研究初步結果表明,BTG基因家族對骨骼肌早期發(fā)育有較明顯的影響,作為豬骨骼肌發(fā)育相關的候選基因對其功能進行深入研究,必將有助于豐富豬分子育種材料并給豬肉生產(chǎn)帶來實質性的幫助。